《动脉粥样硬化》 > 第十八章 血清载脂蛋白的免疫测定第一节 血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价
一、载脂蛋白测定方法
1．单向免疫扩散法（radialimmunodiffusion,RID）
该法较简单，一般实验室均可进行。消耗较多的抗血清，扩散过程至少24h，最多需72h，测定下限值为10μg/ml。该方法虽然简单，应严格控制有关条件如：含抗血清的琼脂糖凝胶厚度要均匀；加入小孔的稀释抗原（血清）量要准确；含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL颗粒大小不一，如琼脂糖凝胶浓度在1.5%～2.0%,可能仅测出LDL的ApoB，大颗粒的LDL及VLDL的ApoB可能无法测出，因为难以穿过琼脂糖凝胶的孔隙。另外，扩散过程中，凝胶板一定要水平，否则易使扩散环呈椭圆形，难以准确测量直径。一般使沉淀环以3.5～10.0mm为宜，应在两个方向测量直径，其精度要求达到0.1mm。采用五种不同浓度参考值，测定沉淀环面积对相应浓度关系以曲线回归方程作图。
2．电免疫测定法（electroimmunoassay,EIA）
该法灵敏，抗血清用量少，如琼脂糖缓冲液中加入聚乙二醇及甘氨酸，其电泳时间可缩短一倍，火箭峰高以1～4cm为宜，火箭峰的测量可以计算面积或峰高，峰高从中心量起。测量精度最好能在0.1mm,灵敏度约2μg/ml，又称为火箭电泳法。
3．免疫比浊法(immunoturbidimetryassay,ITA）
简便快速，在自动分析仪进行操作并能批量检测，是目前临床使用最多的方法学。免疫比浊法有两种：一是测定光散射的，又名免疫散射比浊法（INA）；需用特殊的激光浊度仪；另一种是利用光度计测定通过混浊溶液后的透光强度，称为透射免疫比浊法（ITA），其灵敏度低于INA。比浊法可以终点法和速率法测定，速率法是根据散射光强度与时间的关系，以微机处理计算出抗原抗体复合物形成的最大反应速度，后者与溶液中抗原量成正比，常可在1min内完成测定过程，可自动扣除空白；终点法比速率法稳定，一般多用终点法。
4．酶联免疫法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA）
该技术已广泛应用于极微量蛋白的定量测定，可测出ng级水平的抗原或抗体含量，该法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量较少的载脂蛋白的定量测定。
5．放射免疫法（radioimmunoassay,RIA）
该法灵敏，抗血清用量少，所需设备较多，一般用125I标记抗原作为示踪物，除ApoC-Ⅰ（不含酪氨酸）以外，都可以作碘标记（氯胺T法），以双抗体法测定RIA法可检测最低至3～5ng。临床检验中不常用此法，主要用于动物实验的科学研究工作。
还有荧光免疫法和化学发光法等灵敏度很高的方法。
血清载脂蛋白测定的方法，从测定原理、方法学评价及参考值，刘秉文和李健斋等人作了大量的工作，为国内的载脂蛋白测定的临床应用奠定了基础。周新曾于1986年首先在国内研制成功抗人ApoB100血清，其后，国内同仁陆续研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清，并广泛应用于临床的疾病诊断，在部分大医院已成为常规检查项目。
刘秉文在“脂蛋白与动脉粥样硬化“一书中全面总结了国内外载脂蛋白测定的方法学及其参考值，本节将引用如下比较表：
表18-1 ApoAⅠ免疫测定法的比较
| | RIA | ELISA | EIA | RID | INA | ITA |
| 抗体 | P，M | P，M | P | P，M | P | P |
| 灵敏度（n） | 0.3～10 | 0.1～0.5 | 100 | 100 | 150 | 100 |
| 测定范围（ng） | 1～200 | 0.5～15 | 100～500 | 200～800 | 200～500 | 200～600 |
| 批内CV（%） | 3～9 | 4～8 | 3～5 | 6 | 3～7 | 1 |
| 批间CV（%） | 5～10 | 8～10 | 3～9 | 10 | 6～7 | 6 |
| 正常值（g/L） | 1.0±0.2 | 1.5±0.2 | 1.2±0.2 | 1.2±0.1 | 1.2±0.2 | 1.7±0.2 |
P:多克隆抗体；M：单克隆抗体；RIA：放射免疫法；ELISA；酶联免疫法；RID：单向免疫扩散法；INA：免疫散射比浊法；ITA：免疫透射比浊法。
（源自：刘秉文，1995.）
表18-2 ApoAⅡ免疫测定法的比较
| | RIA | ELISA | EIA | RID | INA | ITA |
| 抗体 | P | P，M | P | P | P | P |
| 灵敏度（g） | 0.5 | | 20 | 5 | 30 | 20 |
| 测定范围（ng） | 1～20 | 5～50 | 30～60 | 50～400 | 50～900 | 40～150 |
| 批内CV（%） | 7 | 8 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 批间CV（%） | 9 | 7 | 8 | - | 7 | 6 |
| 正常值（g/L） | 0.25±0.4 | 0.35±0.05 | 0.76±0.2 | 0.29±0.02 | 0.37±0.09 | 0.36±0.03 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-3 ApoAⅣ免疫测定法的比较
| | RIA | ELISA | EIA |
| 抗体 | P | P | P |
| 灵敏度（g） | 5 | 0.2 | 20 |
| 测定范围（ng） | 5～50 | 0.5～8 | 50～200 |
| 批内CV（%） | 5 | 3.60 | 5 |
| 批间CV（%） | 7 | 8 | 9 |
| 正常值（g/L） | 0.17±0.03 | 0.14±0.05 | 0.14±0.04 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-4 ApoB100免疫测定法的比较
| | RIA | ELISA | EIA | RID | INA | ITA |
| 抗体 | P，M | P，M | P | P，M | P | P |
| 灵敏度（n） | 5～10 | 2～20 | 50～300 | 300 | 300 | 300 |
| 测定范围（ng） | 0～100 | 2～10 | 20～500 | 50～600 | 300～500 | 100～500 |
| 批内CV（%） | 4～8 | 4～7 | 1～7 | 3～7 | 4～7 | 2 |
| 批间CV（%） | 7～11 | 10 | 3～10 | 6～7 | 7～8 | 2 |
| 正常值（g/L） | 0.9±0.2 | 0.85±0.1 | 0.6±0.3 | 0.8±0.2 | 0.8±0.2 | 0.8±0.3 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-5 ApoCⅠ免疫测定法的比较
| | RIA | ELISA | INA |
| 抗体 | P | P | P |
| 灵敏度（n） | 1 | 5 | 50 |
| 测定范围（ng） | 5～30 | 15～100 | - |
| 批内CV（%） | 7 | 3 | 5 |
| 批间CV（%） | 9 | 5 | 8 |
| 正常值（g/L） | 0.05±0.03 | 0.06±0.002 | 0.06±0.01 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-6 ApoCⅡ免疫测定法的比较
| | RIA | ELISA | EIA | RID | ITA |
| 抗体 | P | P | P | P | P |
| 灵敏度（g） | 10 | 0.3 | 45 | 40 | 10 |
| 测定范围（ng） | 10～80 | 0.5～5 | 70～600 | 40～600 | 12～50 |
| 批内CV（%） | 6 | 3 | 6.5 | 2.1 | 3.3 |
| 批间CV（%） | 10 | 8 | 8.2 | 3.9 | 6.2 |
| 正常值（g/L） | 0.04±0.01 | 0.033±0.008 | 0.04±0.002 | 0.039±0.017 | 0.04±0.01 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-7 ApoCⅢ免疫测定法的比较
| | RIA | ELISA | EIA | RID | INA | ITA |
| 抗体 | P | P | P | P | P | P |
| 灵敏度（g） | 1 | 0.3 | 10 | 76 | 20 | 15 |
| 测定范围（ng） | 2～20 | 1～6 | 20～80 | 76～600 | 50～400 | 30～120 |
| 批内CV（%） | 13 | 4.3 | 8 | 2.5 | 6.3 | 5.2 |
| 批间CV（%） | 13 | 4.3 | 8 | 3.5 | 6.3 | 5.2 |
| 正常值（g/L） | 0.15±0.06 | 0.16±0.03 | 0.12±0.04 | 0.127±0.037 | 0.12±0.03 | 0.11±0.03 |
（源自：刘秉文，1995.）
二、人血浆（清）载脂蛋白参考值比较
刘秉文于1995年对国人血浆（清）各项载脂蛋白参考值与国外参考值作了详细的比较，其报道见表18-9、18-10、18-11、18-12、18-13、18-14、18-15。
表18-8 ApoE免疫测定法的比较
| | RIA | ELISA | EIA | RID | ITA |
| 抗体 | P | P，M | P | P | P |
| 灵敏度（n） | 0.2～8 | 0.5 | 20 | 35 | 5 |
| 测定范围（ng） | 0.8～100 | 0.5～6 | 20～200 | 50～300 | 20～400 |
| 批内CV（%） | 6 | 4 | 8 | 5.9 | 2 |
| 批间CV（%） | 9 | 8 | 5 | 7.2 | 5 |
| 正常值（g/L） | 0.05±0.02 | 0.04±0.01 | 0.10±0.04 | 0.035±0.01 | 0.04±0.01 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-9 国人血浆ApoAⅠ含量与国外报道的比较
| 作者 | 发表时间 | 方法 | 例数 | 性别 | 年龄 | 均值±s（mg/dl） |
| 张祖辉 | 1998 | RID | 307 | 男 | 20-77 | 122.1±13.7 |
| 刘秉文 | | | 318 | 女 | 20-77 | 125.5±15.9 |
| 李键斋等 | 1986 | EIA | 291 | 男+女 | 19-50 | 119±17 |
| 周新等* | 1990 | EIA | 692 | 男 | 13-85 | 129.1±16.1 |
| | 477 | 女 | 18-80 | 130.5±14.2 |
| Albers等 | 1976 | RID | 20 | 男+女 | 11.5±7.3 | 115.7±7.3 |
| Cheung等 | 1977 | RID | 172 | 男 | 20-65 | 120±20 |
| 188 | 女 | 20-65 | 135±25 |
| Reman等 | 1978 | RID | 95 | 男 | 40-49 | 137±23 |
| 104 | 女 | 40-49 | 137±23 | |
| Schonfelcl等 | 1974 | RIA | 41 | 男 | 13-58 | 100±35 |
| 34 | 女 | 16-58 | 104±34 | |
| Karlin等 | 1976 | | 23 | 男 | 20-39 | 130±3 |
| 19 | 女 | 20-39 | 154±6 | |
| Avogaro等 | 1978 | EIA | 60 | 男 | 20-60 | 128±22 |
| 60 | 女 | 20-60 | 134±20 | |
| Mordasini等 | 1980 | EIA | 50 | 男 | 20-60 | 113±9 |
| 50 | 女 | 20-60 | 125±17 | |
| Miller等 | 1980 | EIA | 8 | 男 | 34-70 | 122±27 |
| 8 | 女 | 52-68 | 149±20 | |
| Rosseneu等 | 1981 | IAN | 12 | 男 | 29 | 139±15 |
| 14 | 女 | 30 | 147±24 | |
| Assmann等 | 1982 | INA | 3032 | 男 | 20-65 | 136±23 |
| 1367 | 女 | 20-60 | 146±25 | |
（源自：刘秉文，1995）
*：作者补充。
表18-10 国人血浆ApoAⅡ含量与国外报道的比较
| 作者 | 发表时间 | 方法 | 例数 | 性别 | 均值±s（mg/dl） |
| 罗静聪 | 1988 | RID | 76 | 男+女 | 26.7±4.6 |
| 刘秉文 | 1988 | ELISA | 41 | 男+女 | 24.2±5.9 |
| 胡维诚 | 1987 | RID | 160 | 男+女 | 27.0±4.4 |
| Curry等 | 1976 | RID | 19 | 男 | 78.0±1.7 |
| | | | 19 | 女 | 83.0±25 |
| Cheung等 | 1977 | RID | 172 | 男 | 33.0±5 |
| | | | 188 | 女 | 36.0±6 |
| Assmann等 | 1977 | EIA | 15 | 男 | 34.1±5 |
| | | | 15 | 女 | 38.3±5.5 |
| Schonfeld等 | 1977 | RLA | 29 | 男+女 | 40.5±8.9 |
| Maupovic等 | 1981 | ELA | 50 | 男+女 | 68.0±18 |
| Goldberg等 | 1980 | RIA | 50 | 男 | 25.0±1 |
| | | | 50 | 女 | 26.0±1 |
| De Backnev等 | 1982 | INA | 70 | 男+女 | 43.0±6.9 |
| Zech等 | 1983 | RID | 27 | 男+女 | 24.0±0.6 |
| Noma等 | 1983 | RLA | 27 | 男+女 | 32.0±8.3 |
| Nukita等 | 1984 | EIA | 156 | 男+女 | 40.0±9 |
（源自：刘秉文，1995）
表18-11 国人血浆ApoB含量与国外报道的比较
| 作 者 | 发表时间 | 方法 | 例数 | 性别 | 均值±s（mg/dl） |
| 周新等 | 1986 | EIA | 608 | 男 | 83.2±13.9 |
| | | | 511 | 女 | 80.4±13.4 |
| 李健斋等 | 1986 | EIA | 727 | 男+女 | 76±19 |
| 吴兆丰、刘秉文 | 1987 | RID | 304 | 男 | 87.9±14.4 |
| | | | 320 | 女 | 86.7±14.4 |
| Albers等 | 1975 | RIA | 349 | 男+女 | 81.0±20 |
| Bantorich等 | 1975 | RIA | 82 | 男+女 | 90.0±24 |
| Bedford等 | 1976 | RIA | 128 | 男+女 | 87.0±30 |
| Schonfeld等 | 1974 | RIA | 42 | 男+女 | 83.0±16 |
| Brussaard等 | 1980 | EIA | 60 | 男+女 | 63±16 |
| Fruchart等 | 1981 | EIA | 144 | 男+女 | 90 |
| Curry等 | 1978 | EIA | 38 | 男 | 90±2.0 |
| | | | 36 | 女 | 88±11 |
| Curry等 | 1978 | RID | 20 | 男+女 | 87±26 |
| Lees等 | 1970 | RID | 64 | 男+女 | 83±25 |
| Snuderman等 | 1975 | RID | 31 | 男 | 82±22 |
| Fievet等 | 1979 | INA | 206 | 男 | 129±31 |
| | | | 271 | 女 | 120±34 |
| Heuck等 | 1979 | INA | 68 | 男+女 | 82.0±23 |
| Rossenue等 | 1981 | INA | 70 | 男 | 92±13 |
| Durrington等 | 1976 | INA | 29 | 男+女 | 85±11 |
（源自：刘秉文，1995）
表18-12 国人血浆ApoCⅠ含量与国外报道的比较
| 作 者 | 发表时间 | 方法 | 例数 | 性别 | 均值±s（mg/dl） |
| 傅明德等 | 1987 | ELISA | 202 | 男 | 7.6±2.5 |
| | | | 214 | 女 | 8.0±2.3 |
| Polz等 | 1980 | RID | 10 | 男+女 | 6.9±2.0 |
| Curry等 | 1981 | ELA | 68 | 男+女 | 6.0±1.5 |
（源自：刘秉文，1995）
表18-13 国人血浆ApoCⅡ含量与国外报道的比较
| 作 者 | 发表时间 | 方法 | 例数 | 性别 | 均值±s（mg/dl） |
| 傅明德等 | 1987 | ELISA | 202 | 男 | 5.2±1.9 |
| | | | 241 | 女 | 4.9±1.8 |
| 范萍等 | 1989 | RID | 67 | 男+女 | 3.9±1.7 |
| Schonfeld等 | 1979 | RIA | 93 | 男+女 | 3.9±1.4 |
| Curry等 | 1981 | EIA | 68 | 男+女 | 4.0±2.0 |
| Kashyap等 | 1977 | RIA | 32 | 男+女 | 5.0±0.4 |
（源自：刘秉文，1995）
表18-14 国人血清ApoCⅢ含量与国外报道的比较
| 作者 | 发表时间 | 方法 | 例数 | 性别 | 均值±s（mg/dl） |
| 傅明德等 | 1988 | ELISA | 134 | 男 | 11.6±3.6 |
| | | | 135 | 女 | 12.0±3.7 |
| 范萍等 | 1989 | RID | 67 | 男+女 | 12.7±3.7 |
| 刘秉文等 | 1987 | IRA | 21 | 男+女 | 9.2±2.1 |
| Schonfeld等 | 1979 | RID | 93 | 男+女 | 15.4±6.2 |
| Curry等 | 1980 | ELA | 54 | 男+女 | 10.9±3.0 |
| Kashyap等 | 1981 | RIA | 29 | 男+女 | 11.1±0.9 |
（源自：刘秉文，1995）
表18-15 国人血浆ApoE含量与国外报道的比较
| 作者 | 发表时间 | 方法 | 例数 | 性别 | 均值±s（mg/dl） |
| 刘铭锋、刘秉文等 | 1987 | ELISA | 42 | 男+女 | 3.57±1.24 |
| 刘铭锋、刘秉文等 | 1987 | ELA | 50 | 男+女 | 4.70±1.18 |
| 刘铭锋、刘秉文等 | 1992 | RID | 116 | 男 | 3.95±0.98 |
| | | | 122 | 女 | 4.00±1.32 |
| 张东升、夏辉明 | 1991 | ELISA | 25 | 男+女 | 3.45±1.24 |
| Blum等 | 1980 | RIA | 26 | 男+女 | 3.6±1.3 |
| Gregg等 | 1984 | RIA | 12 | 男+女 | 4.8±1.2 |
| Wesgraber等 | 1984 | RIA | | 男+女 | 5(3.5-7.0) |
（源自：刘秉文，1995）
王抒、李健斋等于1996年报道283例血清各项载脂蛋白测定值及百分位数，如表18-16、18-17、18-18所示。这批数据是目前国内采用同一份标本检测脂质、脂蛋白和载脂蛋白项目最多的1次报道。除了作为参考值供临床应用外，并阐明了各项指标之间的相关性。笔者予以抄录，供参考。
表18-16 血脂与脂蛋白水平（mmol/L）
| 项目 | 男（225例） | 女（58例） | P值 |
| TC | 4.87±0.73 | 5.16±0.84 | ＜0.05 |
| TG | 1.27±0.66 | 1.25±0.71 | ＞0.05 |
| HDL-C | 1.41±0.35 | 1.54±0.36 | ＜0.02 |
| HDL2-C | 0.56±0.17 | 0.63±0.19 | ＜0.02 |
| HDL3-C | 0.86±0.23 | 0.91±0.19 | ＞0.05 |
| LDL-C | 2.95±0.68 | 3.13±0.12 | ＞0.05 |
（源自:王抒，1996）
表18-17 几项常用比值*
| 项 目 | 男 | 女 |
| LDL-C/HDL-C | 2.21±0.72 | 2.16±0.80 |
| HDL2-C/HDL3-C | 0.66±0.12 | 0.69±0.15 |
| ApoB/ApoAⅠ | 0.72±0.16 | 0.74±0.17 |
| ApoAⅠ/ApoAⅡ | 4.10±0.65 | 4.10±0．68 |
| ApocⅡ/ ApoCⅢ | 0.39±0.12 | 0.41±0.16 |
男女组间无显著意义
（源自：王抒，1996）
表18-18 各项载脂蛋白测定值与百分位数
| 项目 | X±S | p5 | p25 | p50 | p75 | p95 |
| 男（225例） | | | | | | |
| ApoAⅠ(g/L) | 1.42±0.17 | 1.17 | 1.30 | 1.43 | 1.51 | 1.72 |
| ApoAⅡ(g/L) | 0.36±0.66 | 0.28 | 0.32 | 0.35 | 0.40 | 0.46 |
| ApoB(g/L) | 1.01±0.21 | 0.72 | 0.86 | 1.00 | 1.14 | 1.38 |
| ApoCⅠ(mg/L) | 53±17 | 31 | 43 | 50 | 60 | 83 |
| ApoCⅡ(mg/L) | 34±16 | 13 | 24 | 31 | 42 | 69 |
| ApoCⅢ(mg/L) | 44±17 | 26 | 34 | 41 | 51 | 74 |
| ApoE(mg/L) | 44±17 | 26 | 34 | 41 | 51 | 74 |
| Lp(α)(mg/L) | 144125 | 26 | 53 | 107 | 185 | 382 |
| 女（58例） | | | | | | |
| ApoAⅠ(g/L) | 1.45±0.14 | 1.21 | 1.34 | 1.44 | 1.55 | 1.74 |
| ApoAⅡ(g/L) | 0.36±0.06 | 0.26 | 0.33 | 0.36 | 0.39 | 0.44 |
| ApoB(g/L) | 1.07±0.23 | 0.71 | 0.90 | 1.08 | 1.20 | 1.49 |
| ApoC(mg/L) | 53±18 | 30 | 39 | 51 | 61 | 92 |
| ApoCⅡ(mg/L) | 41±18 | 20 | 28 | 38 | 49 | 77 |
| ApoCⅢ(mg/L) | 104±40 | 52 | 72 | 100 | 129 | 184 |
| ApoE(mg/L) | 51±18 | 33 | 37 | 48 | 58 | 89 |
| Lp(α)(mg/L) | 154±116 | 35 | 66 | 117 | 207 | 464 |
国内的已有报道表明，人血清载脂蛋白参考值水平尚有一定的差异。引起这种差异的原因是多方面的，目前认为主要原因有：①检测方法与仪器不同；②试剂质量尤其是抗血清技术标准不统一；③国内尚未采用完全符合国际标准的定值血清；④人群的生活习惯及种族差异。为此对于国人的血清载脂蛋白参考值的确立，尚需付出艰辛的劳动。