《中国生物制品规程》 > 冻干黄热活疫苗制造及检定规程冻干黄热活疫苗制造及检定规程
本品系用减毒的黄热病毒17D株接种鸡胚，经研磨、离心，取上清液冻干制成。专供进入或经过黄热流行地区的人员预防黄热之用。
1 毒种
1.1 毒种来源
减毒黄热病毒17D株。
1.2 毒种检定
1.2.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
1.2.2 纯毒试验
用已知黄热病毒免疫血清做中和试验，证明其为黄热病毒。
1.2.3 猴体安全及效力试验
取冻干黄热17D毒种，加无菌生理盐水恢复其原液量，接种无黄热病毒中和抗体之恒河猴10只，每只脑内注射0.25ml（50000个小白鼠LD50）。注射后第2、4、6日各采血1次，分离血清，分别做10倍系列稀释。以原血清及10-1～10-3各稀释度的血清分别脑内注射体重10～12g小白鼠6只，每只0.03ml，观察21天，检查病毒量，LD50均不得超过Log2（4天以内死亡的小白鼠不计算在内）。猴子经注射后2～4周，再采血1次，分离血清，做中和抗体测定。10只猴中至少要有9只血清表现阳性中和反应。在1个月的观察期中，发现脑炎症状或因而死亡者不得超过1只猴。
1.3 毒种保存
原毒种和生产毒种批均应冻干后真空封口，保存于-70℃以下。
1.4 毒种传代和生产毒种的制备
取毒种3支，启开安瓿后立即以稀释液（不应含有任何人体蛋白和外源血清或抗体）溶化。待全部溶化后接种于7日龄鸡胚卵黄囊，每胚0.2ml。分2组进行，每组不得少于10胚，置37.5～38℃培育。70～80小时按组收取活存鸡胚，每组不得少于4胚。去眼后分组混合研磨，加稀释液做成悬液，经2000r/min离心10分钟，吸取上清液，在鸡胚中传代，并抽样按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。按同法连续传递2代，传代时可不等无菌试验结果，第3代毒种的鸡胚收获后，吸取容器内液体做无菌试验（方法同上），并将鸡胚冻存于-40℃以下。将无菌试验阴性之鸡胚取出融化。按每胚加入1ml稀释液研磨，经2000r/min离心10分钟，吸取上清液，加入稀释液稀释5倍后置冰浴中待用。同时做毒力滴定。此代即为生产毒种。
2 疫苗制造
2.1 接种鸡胚
用7日龄鸡胚，每胚接种适当稀释度毒种液0.1～0.2ml于卵黄囊，接种后滴蜡封口。
2.2 培育
接种后37.5～38℃培育，70～80小时开始收获。
2.3 收获
收获时剔去死胚，分组收获活存鸡胚，去眼，装入大管中，逐管吸取管内液体做无菌试验，在操作过程中盛鸡胚之大管应置冰浴中保冷，收获完毕置-40℃冻存。
2.4 研磨、离心
2.4.1 研磨
剔除洒菌鸡胚，将冰冻鸡胚大管置冷水中融化，倒入研磨桶内，按每胚1ml加入灭菌双蒸水，用电动研磨机8000r/min研磨3分钟。
2.4.2 离心，收取上清液
将研磨后的鸡胚悬液以减压虹吸法分装于500ml瓶中，塞以胶塞，用2000r/min离心30分钟。离心应在2～5℃进行。
收取上清液，每批装一个球瓶，换以胶塞，保存在冰浴中。
2.5 半成品检定
2.5.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行
2.5.2 冻干前病毒滴定
吸取球瓶中样品，作10倍系列稀释。取10-1～10-6之病毒液，每个稀释度用体重10～12g小白鼠6只，每只脑内注射0.03ml，接种部位忌用碘酒消毒，观察21天，计算LD50。
2.6 分装
疫苗保存在冰浴中进行分装，每安瓿分装量为0.5ml（10人份）。分装后将盛安瓿之金属盒放入-40～-50℃预冻2小时。
2.7 冻干
全部冻干过程为15～17小时，最后5小时升温20～25℃，最高不得超过25℃。冻干后安瓿真空封口。
3 成品检定
3.1 物理检查
外观为略带粉红色的疏松体，水分不应超过3%（g/g），加入稀释液应迅速溶解。
3.2无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
3.3 猴体安全及效力试验
方法及要求见1.2.3项，如生产毒种做过猴体安全及效力试验则疫苗可免做。
3.4 豚鼠安全试验
按原分装量加入生理盐水溶解疫苗，用体重300～500g豚鼠2只，试验前2～3天每天量体温、称体重。然后每只腹腔注射0.5ml，观察7天，每天量体温，应无病症发生。如2只豚鼠均有显著反应（体温超过40℃，体重减轻）或死亡，则该批疫苗应废弃；如有1只豚鼠有症症发生，可再用3只豚鼠重试，重试中如有2只以上豚鼠发病时，判为不合格，制品应废弃；如有1只发病，则再重试，仍有发病则判为不合格，制品应废弃。
3.5 病毒滴定
同半成品检定。每只小白鼠脑内注射0.03ml。病毒滴度应≥3.66LogLD50。
3.6 稳定性试验
由每批疫苗成品取3安瓿，置37℃2周，滴度下降不应超过1Log。
3.7 鉴别试验
每亚批成品应按1.2.2项进行鉴别试验。
3.8 稀释液
氯化钠注射液，其质量应符合《中国药典》规定。
4 保存与效期
应保存于-20℃，自干燥之日起效期为1年半，如保存于2～8℃，效期为6个月。