国食药监注[2005]493号

各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局（药品监督管理局）：
　　为规范疫苗研发行为，指导疫苗研究单位科学地开展研究工作，根据《药品管理法》、《药品管理法实施条例》及《药品注册管理办法》，我局组织制定了《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》、《生物制品生产工艺过程变更管理技术指导原则》、《联合疫苗临床前和临床研究技术指导原则》、《多肽疫苗生产及质控技术指导原则》、《结合疫苗质量控制和临床研究技术指导原则》和《预防用疫苗临床试验不良反应分级标准指导原则》等6个技术指导原则，现印发给你们，并请转发辖区内各有关单位。

国家食品药品监督管理局
二○○五年十月十四日

预防用疫苗临床前研究技术指导原则

前　　言
　　由病毒、细菌或其他病原微生物为起始材料，经培养增殖制成的减毒、灭活的病原体，或再经纯化、裂解、亚单位（包括细菌类毒素）等方法处理制备的富含免疫原性，刺激机体产生特异性免疫学反应而达到预防某种疾病的产品，为预防用疫苗。
　　本指导原则适用于用病毒、细菌或其他病原微生物制备的预防用疫苗，其目的是为该类制剂提供一个共同的原则，指导制定临床前研究的方案，和确定具体的研究内容。
　　一、基本原则
　　（一）应符合国家《药品管理法》等相关法律法规的要求；
　　（二）对所预防的疾病的流行情况进行研究,包括疾病的危害程度 所涉及的人群及病原的型和亚型等；
　　（三）对研制该类制品用于预防疾病的有效性、安全性及必要性进行分析；
　　（四）应对该制品用于预防该疾病的利益风险比进行研究。根据该制品的预防方案可能达到的效果及可能出现的副作用或危害，对总体的利弊权衡进行评价，并提出拟采取避免或减少其危害性或副作用的措施。这种评价将是该方案能否获得批准的重要依据之一。
　　二、用于疫苗研究用的菌毒种
　　研究疫苗所用的菌毒种必须证明为引起本病的细菌、病毒或其他病原体，如该菌毒株分离自人体，下述内容必须清楚。
　　（一）菌毒株名称及来源：
　　1．菌毒株名称
　　2．菌毒株来源
　　（1）分离菌毒株的宿主一般情况；
　　（2）发病地点、发病日期；临床确诊日期、实验室确诊日期；病人病程及病人转归。
　　3．菌毒株分离原样本： 咽试子、漱口液、痰液、血液、粪便、尿液、尸解标本的组织名称；取样日期；取样时病人的病期。
　　4．鉴于人类的血液在同一时间内较少感染多种病毒或细菌，而咽试子、漱口液、痰液、尿液、粪便等样品难免污染其他外源因子，因此用病人血液分离的菌、毒株较适宜用于研究疫苗。
　　5．分离菌、毒株的其他自然样本名称、来源、数量、取样方法等。
　　（二）菌、毒株分离过程
　　1．用细胞分离病毒，所用细胞名称、代次、来源应清楚，应进行细胞无菌检测、支原体和外原因子等检测；病毒分离不宜使用肿瘤原性的细胞系。尽可能使用非肿瘤原性细胞，如人二倍体细胞或Vero细胞等。
　　2．用动物分离病毒，对所用动物名称、品系、级别、年龄、接种途径、饲养条件和制备毒种的动物脏器名称等须详细记载；如再适应到细胞，则还应参照上述对分离用细胞的要求。
　　3．确定分离菌株所用培养基名称、种类，以及分离培养的温度和条件。
　　（三）菌、毒株分离传代特性
　　应包括样品处理方法、首次盲传确证菌毒株阳性代次、菌毒株确证检定方法、每代培养天数、病毒滴度、滴定方法、动物是否发病或死亡等资料。
　　（四）菌毒种建立和保存
　　应包括原始菌毒种代次、滴度，添加的保护剂的名称和浓度、存储条件等资料；原代菌毒种是指已适应到可生产疫苗的细胞或培养基，可稳定传代、保留抗原性、并经过检定可用于疫苗生产的菌毒种。种子批的建立应符合现行版《中国药典》“生物制品制品检定用菌毒种管理规程”的要求，应对种子批进行菌毒种的传代和限定代次的研究，以证明主种子和工作种子批在规定代次内的生物学特性与原始菌毒种的一致性。
　　（五）菌毒种的检定
　　1．鉴别试验：可采用血清学、生物学、核酸序列分析等方法证明为该菌毒种。明确该病原体及其它相关生物分子的基因序列及结构，并与我国主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性进行分析以及明确其血清型、亚型和/或基因型，对该种基因型或血清型的流行情况进行分析，若存在不同的血清型或基因型，应对所选择的血清型或基因型与其它血清型或基因型交叉反应或交叉保护性进行分析和研究。
　　2．无菌检查：按照现行版《中国药典》的要求进行，应符合规定。
　　3．外源因子检查：按照现行版《中国药典》的相关要求进行，应符合规定，取样量应足够检测试验的需要。
　　4．扩增能力和感染性滴度：应能达到按生产工艺要求顺利生产合格疫苗的要求。应建立测定菌毒种扩增能力和感染性滴度的方法和标准，并提供这些扩增能力和感染性滴度与疫苗有效性之间的相关性数据。
　　5．免疫原性检查：菌毒种的免疫原性是衡量该疫苗是否有效的重要指标，应制定和建立测定菌毒种免疫原性的有效方法和标准，以评估该候选菌毒种能否进行疫苗生产。
　　6．减毒特性
　　（1）如研制减毒活疫苗应对原始菌毒株的生物学、血清型、基因型和免疫原性进行研究；减毒方法、减毒过程、减毒程度和减毒后的生物学、血清型、基因型和免疫原性，并进行减毒前后的特性对比，尤其要对减毒后的安全性和免疫原性作出确切的结论；
　　（2）应建立减毒特性指标的验证方法、动物模型和减毒后安全性的标准以及检测和警戒毒力回复的依据等；
　　（3）对制备注射剂的减毒活疫苗，除一般的外源因子检测外，还应验证无逆转录病毒的污染。该验证方法可采用PERT法；
　　（4）如已知该病毒具有嗜神经毒性，其验证要求可参考《IABS Scientific workshop on neurovirulence test for live virus vaccines, WHO,31 January 2005》。
　　三、疫苗的生产工艺研究
　　（一）建立菌毒种库
　　应建立三级种子库。对种子库的遗传稳定性进行分析，明确该种子库可以传代的次数。生产用菌毒种、细胞和涉及生产的工艺技术应注意专利，应进行相关专利查询。
　　（二）生产用细胞和/或培养基
　　1．生产用细胞应符合现行版《中国药典》中“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”的要求，如用传代细胞系应建立三级细胞库；
　　2．生产用培养基尽可能避免使用动物来源和可能引起人体不良反应的原材料，禁止使用来自疯牛病疫区的牛源性原材料。
　　（三）疫苗原液生产工艺的研究
　　1．生产工艺的主要技术参数的确定
　　（1）病毒与细胞的接种比例、MOI的最佳参数、细胞培养和病毒培养的最佳温度、培养时间和收获时间。菌毒种的接种量，培养和发酵条件等技术参数的研究确定；
　　（2）灭活剂的选择和依据；
　　（3）灭活或裂解条件及灭活或脱毒效果的验证，灭活效果验证的依据、方法；灭活效果的验证，应采用尽可能敏感的细胞或培养基和方法进行；
　　（4）原液的浓缩和/或活性抗原的提取纯化等工艺研究：纯化和提取工艺中各种条件进行优化，纯化和提取工艺对抗原活性成分是否影响，应建立稳定的纯化工艺，包括纯化时的回收率、抗原活性和纯度等的稳定性；并制定相应的质控指标和检测方法，按GMP要求在符合GMP要求的生产环境下生产；
　　（5）初步确定起始投料、原液、半成品和成品的产出比的理论数据。
　　2．疫苗对佐剂的要求
　　目前能用于疫苗的佐剂多为氢氧化铝，而铝佐剂通常使疫苗产生的抗体滞后，且增加注射局部的副反应机率。如疫苗的抗原能满足免疫的需要，则不加佐剂为宜。如果在终制品中使用佐剂，则对以下问题应进行研究，对于已经明确有佐剂效应或者已经商品化的佐剂，只需提供该类制剂的组分或化学组成，国内外使用该类制剂的情况，无需再进行毒理和安全性研究。若国内外均未使用过该类佐剂,则必须对其作用原理、安全性及佐剂效应进行详细的研究并建立切实可行的评价方法。
　　（四）疫苗的配方研究
　　应对疫苗的配方进行研究，如疫苗中添加的稳定剂成分，缓冲液、佐剂、以及冻干疫苗的赋形剂成分等是否对疫苗造成影响。
　　四、药理、毒理和生物分布
　　疫苗不同于一般的化学药品，药理、毒理的实验要求具有特殊性，因此，该制品的药理学试验主要包括发生作用的原理、生物效价与剂量的关系、免疫程序和接种途径与效果的关系等；在毒理学方面主要考虑接种部位和全身的病理反应、以及机体对该疫苗的非期望的免疫应答反应和这种反应的持续时间。由于以上各方面是互相关联的，因此，应综合考虑药理、毒理和免疫原性或生物效价的因素。
　　应建立适当的试验及检测方法来评价疫苗的免疫原性或生物效价，如果有动物模型或可建立动物模型的，可以采用动物模型直接评价疫苗的生物效价，如：对一些有动物模型的感染性疾病，可以采用病原体的攻击实验来评价该疫苗的保护效果。而且要建立剂量与生物效价的关系，通过实验优化免疫程序和接种途径。若无法建立动物模型，应建立能验证该疫苗有效性的体外实验进行评价。
　　灭活疫苗的生物分布较难检测和评价。减毒活疫苗的生物分布应建立敏感的动物模型，可测定接种疫苗后的病毒血症（或菌血症）以及持续时间，排毒（菌）方式和途径，对是否呈现体内复制及感染的器官组织细胞应进行详细的研究。
　　五、质量控制及检定的要求
　　（一）生产过程中质量监控标准的建立及要求
　　在生产工艺的各个环节和步骤中的产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进行,保证产品的质量、工艺的稳定性。
　　（二）产品的质量检定与要求
　　1．外观检查：根据样品的特征建立外观的质量标准。
　　2．pH值检测：可根据一般生物制品的要求建立标准，一般为7.2±0.5。
　　3．纯度：主要用于评价纯化制品中含有有效成分的量和杂质的最低限量，制定相应标准，通常可测定有效抗原在疫苗中的绝对值或测定主要杂质的量推算有效抗原在疫苗中的相对值。
　　4．宿主细胞 DNA和蛋白残留量检测：采用传代细胞生产疫苗，应限制疫苗中的宿主细胞DNA和蛋白残留量，进行方法研究时应建立相应的标准品，并对检测试剂的敏感性和特异性进行验证。疫苗中残余宿主细胞DNA及蛋白残留量可参考现行版《中国药典》的相关要求。
　　5.无菌检查：应符合现行版《中国药典》的相关要求。
　　6．热原或细菌内毒素检查：可参照现行版《中国药典》的相关要求进行； 也可以用其它方法检测疫苗中的热原物质。
　　7．抗生素检测：预防用疫苗在生产过程中不得添加青霉素或其他β内酰氨类抗生素；如在生产过程中添加除上述以外的其他抗生素，应建立相应的检测方法并规定抗生素残留量的要求。
　　8．灭活效果的验证：由于制备疫苗的病原体一般均对人类致病，因此应建立有效的灭活方法对该制品中的病原体进行灭活，并应对灭活效果进行验证；在成品检定中应建立灭活剂残留量检测的方法和限度标准。
　　9．异常毒性检查：应符合现行版《中国药典》的相关要求。
　　10．稳定性试验：是指疫苗在常规保存温度下的稳定性试验。由于稳定性试验的结果直接与制品的效期有关，且试验观察时间较长，因此应在生产工艺确定后尽早留样进行，定期取样测定制品效力和其他相关的质量指标；对稳定性试验结果与加速稳定性试验数据进行分析对比，可为正式产品的有效期确定提供依据。
　　11．效力试验（生物效价）：由于用于预防的疫苗是通过机体的免疫应答反应发生作用的，因此应评价其体液免疫和细胞免疫的生物效价。在评价体液免疫效价时，应选择实验动物的品系，建立检测动物血清抗体的诊断试剂，并对该类试剂进行验证，可以计算小鼠ED50以及抗体产生的滴度，如有必要和可行，还应当建立评价抗体质量的方法，对抗体的性质进行评价，如亚型测定及抗原中和位点分析等；在评价细胞免疫效价时，应当建立检测评价细胞免疫的方法（如特异性CTL反应的方法或Elispot方法等），也可通过对细胞因子的定量检测评价其细胞免疫情况，如属于常规检定项目，该类方法应稳定、重复性好、可操作性强，并制定相应的质量标准。若有动物模型，可进行动物保护性实验。
　　12．佐剂的质量评价：如最终制品含有佐剂，则应建立佐剂含量以及与之结合率的检测方法，并制定相应质量标准。
　　13．疫苗标准品或参考品的研究：对于一种新疫苗而言，建立检测疫苗的效力、免疫原性或毒性用标准品或参考品对判断验室研究阶段与批量投产后的疫苗质量是否一致以及临床试验的评价是非常重要的。
　　六、临床研究用样品要求
　　（一）申请临床试验用的疫苗，按照国家GMP的要求,在符合现行中国药品GMP的生产条件下生产的。
　　（二）临床试验用疫苗样品应尽量使用与临床前研究相同批的疫苗,其批量一般不少于1000人份，并能满足临床试验对疫苗量的要求。
　　（三）进行临床试验的疫苗必须由中国药品生物制品检定所进行质量复核。

生物制品生产工艺过程变更管理技术指导原则

前　　言
　　本指导原则适用于已经取得生产文号的生物制品生产过程等发生变更的管理技术指导原则，所指生物制品生产过程变更是指生产者对已获国家药品管理当局批准的生产全过程中的任何过程所进行的任何变动。包括从开始生产至终产品的全过程，及与生产相配套的辅助设施。其中包括原液制备，半成品配制及成品分装等；变更后需重新申报按新药管理的或重新申请生产文号的不包括在此范围之内。
　　本指导原则首先以国家颁布的相关法规及技术指导原则为基础，并应符合国家的相关要求，如国家现行GMP规范要求。
　　一、原则
　　（一）任何生产过程的改动都是以提高产品的安全性和有效性为基本出发点，在提高或至少不改变最初国家批准产品安全性和有效性的基础上进行相关改进。
　　（二）拟进行生产过程变更的生产企业应向SFDA提出申请，并递交相关方案和资料，提供证明资料，说明该变更不引起产品质量的内在变化，由SFDA组织专家进行审查并确定变更的类型及应递交的相关材料。
　　二、概述
　　（一）生产过程变更：根据其对终产品质量的影响，一般分为以下3种情况。
　　1、变更引起产品内在质量发生改变的，需要按新药申报程序进行申报为I类，请参考《药品注册管理办法》附件4药品补充申请注册事项及申报资料要求；
　　2、变更可能对产品的安全和有效性有影响的为II 类，需报SFDA审批；
　　3、一般不影响产品安全性和有效性的为III 类，需报SFDA备案。详见下表。

生产变更分类表

───────────────────────────────────────
　　　　　　　　生产变更内容　　　　　　　　　　　　　　类　型

───────────────────────────────────────

一、主要原辅材料
　　    原料或起始原材料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　    培养基或其主要成份　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　    关键原辅料的来源　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　    牛血清及胰酶等　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II

二、菌毒种库及细胞库
　　    原始种子库　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　    主代种子库　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　    工作种子库　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　III

三、生产工艺
　　    减少或增加工艺步骤　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　    病毒灭活方法变更　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　    培养时间变更　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　    分离、纯化方法变更　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　    参数变更　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　    缓冲液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　III
　　    生产规模改变　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II

四、配制
　　    防腐剂　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　    佐剂（新佐剂除外）　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　    赋型剂　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　    稳定剂　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　    稀释剂（新稀释剂除外）　　　　　　　　　　　　　　　　III

五、成品
　　    检定方法　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　    质量标准　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I

六、主要生产设备（如消毒、冻干、分装、发酵罐血液制品生产　I
　　    用离心机、压滤机）
　　    一般生产设备　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II

───────────────────────────────────────

（二）生产过程变更均应进行相关的技术评价，并应进行验证。
　　1．原材料或起始原材料
　　　 * 变更理由说明；
　　　 * 变更后产品有效成分生物学改变情况的研究数据；
　　　 * 变更前、后的有效成分情况的改变、质量标准异同及质量检定报告；
　　　 * 至少连续3批中间产品、原液、成品的质量分析报告及质量标准的修订；
　　　 * 生产过程中有效成分检测及稳定性的数据。
　　2．培养基主要成份
　　　 * 变更前、后的培养基成份改变情况、检测方法及质量标准和检定报告；
　　　 * 培养基成份改变对产品有效成分生物学影响的技术数据和验证资料；
　　　 * 非BSE牛源地的证明材料。
　　3．菌毒种、细胞株主代种子库
　　　 * 种子库制备、分析、检定资料；
　　　 * 连续3批产品质量分析资料，包括生产各关键阶段中间品、成品的分析、生物学检测；
　　　 * 应进行必要的安全、有效性研究，包括临床试验。
　　4．生产工艺部分变更，如增加、减少分离步骤或由精制改为柱层析
　　　 * 变更原因说明；
　　　 * 工艺验证资料；
　　　 * 连续3批产品质量分析资料，包括生产各关键阶段中间品及终产品的分析、生物学检测；
　　　 * 两种工艺条件下产品主要有效成分生物有效性和质量的比较及稳定性研究；
　　　 * 应根据生产工艺变更的具体情况，进行必要的安全、有效性研究，必要时进行临床试验。
　　5．病毒灭活方法变更
　　　 * 变更原因说明；
　　　 * 病毒灭活验证资料；
　　　 * 连续3批产品质量分析资料，包括生产各关键阶段中间品及终产品的分析、生物学检测；
　　　 * 根据情况进行适当的临床试验。
　　6．培养时间改变
　　　 * 变更原因说明；
　　　 * 培养时间的优化研究资料；
　　　 * 变更前、后主要有效成分生物学变化的研究；
　　　 * 连续3批产品质量分析资料，包括生产各关键阶段中间产品、原液及终产品的分析、检测及稳定性研究资料；
　　　 * 根据情况进行适当的临床试验。
　　7．分离、纯化方法的变更
　　　 * 变更说明；
　　　 * 验证资料；
　　　 * 变更前、后主要有效成分生物学变化的研究；
　　　 * 变更前、后连续3批产品质量分析资料，包括生产各关键阶段中间产品、原液及终产品的分析、检测及稳定性研究资料；
　　　 * 应进行适当的临床试验。
　　8．缓冲液、参数改变；
　　　 * 变更原因及变更前后缓冲液组成对比；
　　　 * 变更前后主要有效成分生物学变化数据资料；
　　　 * 连续3批产品质量分析资料，包括生产各关键阶段中间品及终产品的分析、生物学检测及稳定性研究资料；
　　　 * 应进行适当的临床试验。
　　9．生产规模改变（单批10倍以上规模）
　　　 * 关键设备、工艺变更后的验证资料；
　　　 * 两种生产规模连续3批产品质量分析资料，包括生产各关键阶段中间品及终产品的分析、生物学检测的对比数据；
　　　 * 新规模条件下产品质量的稳定性研究；
　　　 * 根据情况进行适当的临床试验。
　　10．主要生产设备的变更（如消毒、冻干、分装、发酵罐、血液制品生产用离心机、压滤机）
　　　 * 变更原因说明；
　　　 * 变更后的设备和工艺验证资料；
　　　 * 变更前、后主要技术参数的对比，及变更后的关键指标检测；
　　　 * 变更前、后连续3批产品生产与质量分析资料；
　　　 * 必要时进行稳定性研究；
　　11．防腐剂、佐剂、辅料；
　　　 * 变更原因说明；
　　　 * 变更后防腐剂、佐剂、辅料的配制方法及质量标准；
　　　 * 变更前、后产品主要有效成分生物有效性的对比研究资料；
　　　 * 变更后产品的质量标准；
　　　 * 稳定性研究；
　　　 * 必要时进行适当的临床试验。

联合疫苗临床前和临床研究技术指导原则

前　　言
　　联合疫苗是指含有二个或多个活的、灭活的生物体或者提纯的抗原，由生产者联合配制而成，用于预防多种疾病或由同一生物体的不同种或不同血清型引起的疾病。如果将载体疫苗和偶联疫苗的载体菌或偶联的载体成分所引起的疾病也作为其适应症时，则载体疫苗和偶联疫苗也属于联合疫苗。
　　在本指导原则中根据联合疫苗的研究经验和结果,提出了有关临床前研究和临床研究中应注意的问题和要求。论及的内容不可能面面俱到，在实际应用中可能会遇到许多技术问题，对于特定问题和特定的制品，应视具体问题具体研究决定。本指导原则亦将随科学技术发展和经验积累而逐步完善。
　　一、联合疫苗研究开发中应考虑的问题
　　联合疫苗的研发过程中，应对联合后疫苗各组分间的相互作用，以及防腐剂、佐剂和非活性成分等对联合后活性成分的影响等进行研究。应证明联合后的疫苗在安全性和有效性方面至少与单价疫苗是相等的。
　　（一）组分间的相容性
　　以往的经验表明，单价疫苗在联合后会使疫苗的安全和效力发生改变。有时联合疫苗中的某种成分会对其他的一种或多种活性组分起到抑制或增强的作用，例如：当全细胞百日咳疫苗与灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）联合后会使百日咳的效力下降；另外，当用活疫苗配制联合疫苗时，可产生病毒间或病毒亚型间的免疫干扰，其免疫应答比单病毒组分疫苗的免疫应答要低；由活疫苗配制的联合疫苗，也可能发生组分间的重组反应，可能使减毒活疫苗毒力回复。因此，在开展临床试验前，应对联合疫苗中各组分间的相容性进行验证。应采用适宜的理化、生化和生物学检测方法，对制品的特性和组分的完整性进行测定。为了进一步证明组分间的相容性，在临床前的研究中，应采用适当的动物模型，确定联合后对各组分的效力和免疫原性是否有影响。还应当考虑到联合疫苗中的每一组分都有可能通过联合使毒力回复。因此，应当测定组分在单价时和联合时是否有恢复变异的趋势。同时，还应评价制品的再悬浮的影响，以及容器和瓶塞与联合疫苗是否相匹配。
　　（二）防腐剂对联合疫苗的影响
　　防腐剂或稳定剂有可能改变疫苗的效力，如DTP-IPV中的硫柳汞可抑制IPV的效力；应考虑防腐剂对组分毒性逆转的影响，还应考虑定量测定各成分或抗微生物物质的残余量，以及进行防腐剂对成品抗污染能力的研究。
　　（三）佐剂对联合疫苗的影响
　　应研究佐剂与其他组分间的相容性及对每一成分的吸附度，同时还应考虑多个组分若同时吸附时的吸附效率和动力学。对于未被吸附（游离）的组分在配制后吸附情况，例如未被吸附的组分是否会被吸附；已吸附的组分是否会被解离下来，即研究存放时间对佐剂吸附抗原的影响等。对于以前未被吸附过的组分，应研究吸附后对检测方法和检测结果是否会产生影响，应了解对鉴别试验或热原试验方面的影响。
　　（四）非活性成分对联合疫苗的影响
　　在配方的开发阶段，应当测定不同的缓冲液、盐类、稳定剂（比如乳糖、明胶、山梨醇等）以及其他化学因素是否对疫苗的安全性、纯度或效力产生有害的相互作用。
　　（五）稳定性和有效期
　　在稳定性和有效期的研究时，应使用三批成品考核实际贮存时间内制品的稳定性，以制定该制品的有效期。由于疫苗的有效期是从成品的效力试验开始计算的，所以还应考虑以下三个方面对疫苗有效期的影响，即生产过程中和配制前每一组分的保存时间、效力试验开始前后的联合疫苗的保存时间。联合疫苗的有效期的开始时间应当是从测定联合疫苗中的第一个组分的最后一次有效的效力试验开始（或合格）之日。按有效期最短的组分确定联合疫苗的有效期，即应综合考虑各组分的有效期。所制定的成品有效期应当确保制品在其总有效期内（即有效期开始前的贮存期加上成品的有效期）各组分都是稳定和合格的。
　　二、联合疫苗生产中应考虑的问题
　　生产过程中应考虑的主要问题是生产的一致性，即生产的稳定性，应证明在已确定的生产条件下生产出的产品是稳定和一致的。
　　（一）连续批的数量和规模
　　用于稳定性研究的成品最好是用连续三批原液配制的，应在规模化的生产设施中进行，至少有一批是在大规模生产状态下生产的，以表明该生产工艺在其生产规模改变时是否会对产品的安全、纯度和效力产生影响，尤其对于吸附类产品和不易再悬浮的产品，其成品的质量有可能受到吸附效率或者联合步骤的影响。
　　（二）单价组分混合时应考虑的问题
　　在配制联合疫苗时每一种抗原应至少使用三批，但对已获生产文号的抗原（单价疫苗）可少于三批，没有必要对联合疫苗中所有组分的连续批进行联合配比的测定，但应当证明疫苗中每一抗原组分的生产一致性。可采用下述联合配比方法的距阵表或采用随机采样法，例如：X、Y、Z等组分配制的联合疫苗可采用每一组分的第一批联合后得到成品为第一批，即X1+Y1+Z1+...N1配制得到最终成品为批号1，X2+Y2+Z2+...N2配制得到最终成品为批号2，X3+Y3+Z3+...N3配制得到最终成品为批号3。采用这种方式配制可减少成品的批数。
　　三、联合疫苗检定中应考虑的问题
　　（一）一般要求
　　对生产的每一批制品都要进行检测，证明其质量达到了相应的质量标准，以保证制品在安全、纯度和效力方面的质量。如果目前尚无令人满意的联合疫苗检测方法，应尽快开发新的检测方法，以测定每一种组分的含量或效价。
　　（二）效力试验
　　应当测定联合疫苗中各有效组分的效力，其效价应当达到单价制品的规程要求。如果不能达到规程要求时，应证明其效价降低是由于联合疫苗中组分间的相互作用所致，并证明降低的效价不会导致人群免疫后低的免疫应答。如果已经证明后序的生产工艺对原液的效价没有影响时，可以用对原液的效价测定代替对成品的效价测定，但冻干制品必需对成品进行效价测定。对含有佐剂的疫苗，抗原的吸附度对制品的效价会产生较大的影响，因此应测定成品的效力。效力试验应能证实组分间的相互作用使某一种组分对其他组分产生增强或减弱作用。效力试验可以用动物免疫原性试验，对每一种抗原的免疫应答以及应答的质量都应进行研究，这些研究应当包括测定抗体的分类、亲和力、亲和性、抗体动态变化或功能，例如测定中和靶抗原或毒素的能力。最好是用动物试验比较联合疫苗与单个抗原的免疫应答情况，以确定是否发生了免疫应答的增强或抑制现象。同样，也应在动物免疫原性研究中测定活疫苗株之间的免疫干扰现象。
　　对于一个新的疫苗或者联合疫苗中含有人体未曾使用过的新抗原，只要有动物模型，就应当首先用动物模型对其保护力进行研究。保护力试验应当采用拟预防疾病的有毒株来攻击。应当按照经统计学和经科学验证的试验步骤对试验结果进行确认，并应详细描述。此项试验应在产品的开发早期进行。
　　（三）鉴别试验
　　应对联合疫苗中每一活性组分进行检定，目的是证明制品的内容物与其标签的标示相一致。
　　（四）无菌检查
　　联合疫苗中的各组份以及成品疫苗均应符合无菌试验的要求。对含有残余抗生素、含有未曾使用过的防腐剂或含有颗粒状佐剂的制品，对其半成品和成品的无菌试验应进行研究，并建立适宜于这些制品的无菌试验方法。
　　（五）纯度试验
　　联合疫苗中每一种组分均应达到该组分的纯度要求，如Hib－DTP偶联疫苗中的Hib组分，即使与已知含有内毒素的DTP配制成联合疫苗，也应当符合Hib制品热原试验的要求。在此种情况下则不要求对成品进行热原检查。此外，对组分进行纯度测定用的SDS-PAGE检测，也不适用于成品。
　　四、联合疫苗临床研究中应注意的问题
　　联合疫苗的临床研究与其他疫苗一样首先应遵循《药品临床试验管理规范》（GCP）的要求。由于联合疫苗是多组分的，在临床研究中对于安全性和有效性的研究与单一成分的疫苗有所不同，应注意以下几方面的问题。
　　（一）安全性研究
　　一般来讲，联合疫苗的安全性研究是与同时在不同部位接种联合疫苗中的每一种单价组分疫苗进行比较，例如，接种DTP-HB疫苗与分别接种DTP和HB疫苗进行比较。临床试验应是随机的，且应设对照组，如分别在不同部位同时注射联合疫苗中所含有的单价组份疫苗的对照。
　　临床试验中应观察接种后的不良反应，还应进行跟踪研究，应在临床研究开始前确定不良反应的判定标准和跟踪研究方案。一般灭活疫苗应进行7天的主动监测，活疫苗应进行14天以上的主动监测，还应进行30 天电话随访或采用调查表的方式。观察的不良反应包括全身反应如：发热、不适、头疼、呕吐、哭闹，及红斑、硬结、疼痛、 触痛等局部反应；以及不常见或罕见的不良反应。
　　（二）免疫原性研究
　　应当对联合疫苗中所有组分的免疫原性进行研究。应当将联合疫苗的免疫原性与分别同时接种在不同部位的各单价组分疫苗的免疫原性进行比较，如果联合疫苗中的某些组分是已获生产文号的，那么，该已获得文号的单组份疫苗可以用于免疫原性研究的对照组。联合疫苗中的每一种血清型或组分在联合疫苗中均应有相应的免疫原性要求。在临床试验方案中应包含各组分免疫原性与其保护性之间关系研究的要求。
　　评价每一组分的免疫原性的参数是非常关键的，应广泛征求有关专家的意见，确定评价疫苗免疫原性的参数以及各参数的合格标准。一般来讲，抗体水平和血清阳转对于临床保护性只起一定的参考作用。应当注重抗体的质量而不是仅仅是抗体的量，例如，抗体的亲和性、功能、抗原决定族的识别位点以及其他规定的参数对确定应答抗体的质量是非常重要的。
　　免疫原性比较研究的目的旨在证明联合疫苗接种后各组份疫苗的免疫应答与同时分别接种联合疫苗中的各单组份疫苗后的免疫应答之间是否有显著区别。研究的设计应能证明联合疫苗与原单价疫苗的免疫原性相一致，应能证明和排除在临床上抗体几何平均滴度（GMTs）和/或者血清阳转率方面的显著性差别，同时应考虑测定方法和受试者的内在变化的影响。临床试验方案中应对联合疫苗接种后各单组份疫苗的免疫应答与直接接种单组份疫苗的免疫应答可能存在的显著差别作出明确的定义，在试验假设中应清楚地表明哪些差别是将被排除的，并且以此来计算出受试人群的大小。应当对任何观测到的差别评价其临床相关性，对每一个组分在免疫剂量或免疫程序上的改变，均应有临床数据作为其改变的依据。
　　用于临床验证的制品批数可以比用于生产一致性研究的批数少。但是，在某些情况下，例如制品中含有未获生产文号的组分时，临床验证时应使用更多的批数，应至少有一批是用于生产一致性研究的制品，并且，应采用制备联合疫苗的同批单价疫苗进行接种的对照组试验，以避免由于批间的不同而引起免疫原性的不同。对所使用的疫苗批间的差异要进行分析。因此，临床试验也应考虑以上因素对临床研究结果的影响。
　　（三）有效性研究
　　每一组分的有效性均应经过临床试验得到证明。比较理想的临床试验是前瞻性的、随机的和有对照的。评价有效性所使用的判定终点，一般是疾病的发病率，但也可以是已经确定了的“保护性相关指标”。疫苗有效性试验中所使用的保护性相关指标，应为经过充分验证的和临床试验证明的可以保护该疾病的实验室参数。如果一个免疫学的保护性相关指标在能够确定质和量的相互关系时，就可以代替流行病学指标。具有一定滴度的某些类别的抗体与保护性具有相关性，例如免疫后破伤风抗毒素的中和抗体单位大于0.01IU/ml时，则认为可保护受试者免于破伤风的发生。
　　如果联合疫苗中的单组分疫苗的保护性效力是经过证实的，这一研究结果可以作为参考资料来支持联合疫苗的研发。在临床试验时，可采用与单价组份疫苗的桥接试验来比较联合疫苗中这组份疫苗的保护性效力。
　　如果联合疫苗免疫后产生的抗体水平低于单价组分疫苗，但仍能达到保护性作用的，应提供相应的数据或资料证明其保护的有效性及持久性。
　　在评价制品有效性时，一般不选用病例对照试验（case-control）。由于该试验在许多方面有可能产生偏差，因此，在采用该方法时，应在试验方案中详尽地阐述如何降低偏差和采取的纠正措施。
　　一般来说，测定多价血清型的联合疫苗中每一个血清型的效力是比较困难的。因此可采用相应的替代方案。应当根据目标人群中相应血清型疾病的发病率设计此类疫苗有效性的临床试验。如果临床试验的判定终点是以该疫苗所预防的各型疾病发病率的总和时，该试验应当具有相当的规模，即确保发病率低的血清型仍能有一定数量人群的数据，以评价其有效性。
　　对于多价血清型的联合疫苗，由于缺乏足够数量的病例而不能够进行临床有效性的评价时，在某些情况下，可以用免疫原性的数据推断其有效性。如果在临床上已经证明了血清学和有效性存在着相关关系时，可以使用免疫原性数据推断其有效性。
　　（四）数据统计
　　临床研究中很重要的一个问题是确定受试人群的大小。现在尚无计算联合疫苗临床试验受试人群大小的标准，评价主要基于统计学、临床学和基础科学的评价结果。
　　多数联合疫苗的临床试验均以在不同部位分别接种各组分疫苗或接种各组份混合后疫苗为试验的对照组，受试者应当随机地分配到各疫苗组。按照受试者的特性（如：年龄或者到达试验点的日期）分组的方法不符合随机分配的原则。
　　为了证明联合疫苗与单价疫苗等效性的临床试验，应当设计一个拒绝有区别的假设试验，而不是传统意义上的无区别的“无效”假设试验。为了证明发生率和比例相同或等价时，采用单侧检验是适宜的，因临床试验的目的在于证明注射联合疫苗与分别注射的单价组分疫苗无明显差异。
　　如果要证明联合疫苗优于分别注射的单价组分疫苗，应当设计一个检验差异的临床试验，而不是一个检验等价的试验。
　　对于免疫应答，一般分析接种后的GMT或GMR（应答率的几何均值），通常是为了排除联合疫苗和分别注射的单价组分疫苗间在临床上有意义的差别。对于要排除事先规定的差别的临床试验规模，应计算考虑受试人群的大小。
　　如果联合疫苗的免疫应答未显示明显地低于分别注射的单价疫苗，那么，可采用双侧的生物等价检验来分析GMT。理想的设计是联合疫苗诱导所产生的抗体滴度既不比预先规定的量太低也不会太高。
　　临床结果分析时，应同时进行血清的阳转率与抗体滴度的分析比较研究。在没有保护性替代指标的情况下，如果没有阳转率与GMT间的分析和评价是很难得出结论。如果已经建立了保护性免疫的替代指标，在评价联合疫苗和分别注射的单价组分疫苗间的差别时，就应当考虑保护性免疫替代指标。
　　对于评价常见的不良反应，试验组中联合疫苗为一个接种部位，而对照组为二个或多个接种部位，这种对比分析试验不是双盲的。因此，在分析时应将单部位接种的反应（联合疫苗组）与多部位接种（对照组）当中反应最严重的一点进行比较。还应考虑到在个体内的不同组分间的相互作用。
　　对于不常见的不良反应的评价，临床试验中应根据疫苗目标人群的大小来确定受试人群的大小。
　　对于罕见的不良反应的评价，受试人群的规模应当足够大，如果未观察到不良反应，可认为在目标人群中发生的可能性也很低。
　　总之，联合疫苗的研发和临床试验不同于一般疫苗，除一般要求以外，还应充分考虑多种组分联合后产生的相互作用对联合后疫苗的安全性和有效性的影响，以及是否产生毒性逆转或重组。在临床试验时，应采用联合疫苗中各组分分别但同时接种作为对照组，由于对照组是多部位接种，给不良反应的评价带来了困难，同时还应充分考虑各组分在体内的相互作用而产生的影响。因此，不能简单地采用一种固定的模式研究联合疫苗的安全性和有效性。

多肽疫苗生产及质控技术指导原则

前　　言
　　多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。传统疫苗一般由两种方式制备，一种为能诱发免疫力却不致病的减毒疫苗，例如黄热病、脊髓灰质炎和麻疹疫苗或卡介苗；另一种为灭活疫苗（例如百日咳杆菌、狂犬病毒、伤寒杆菌）。多肽疫苗由于完全是合成的，不存在毒力回升或灭活不全的问题。特别是一些还不能通过体外培养方式获得足够量的抗原的微生物病原体。有些虽能进行体外培养，但这些病原体有潜在致病性和免疫病理作用等涉及安全性与有效性的问题。多肽作为体内引起效应细胞免疫应答形成的免疫原，将成为一种新型的疫苗，但还有很多理论和技术问题要继续研究，目前尚无多肽疫苗获准上市。因此，应采取适当可行的途径对这种潜能疫苗进行生产及质控，并在其生产过程中积累经验，为此，应加强咨询和论证，以便提出一个确保安全有效而又适合实际的申报资料。同时，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终产品的制备，务必制定标准操作规程和质控标准，并予严格实施。
　　一、多肽疫苗的化学合成
　　首先应该确定天然抗原的氨基酸序列，选择和确定寻找有效肽段的方法，并寻找该肽段所针对的抗原决定簇。
　　其次应选择合适的合成方法。合成中等大小的多肽也会涉及众多反应，每加入一个氨基酸需多次反应，在一个氨基酸的α氨基与另一个氨基酸的羧基缩合形成肽链之前，必须使其中一个形成高反应的活化状态，这个选择自然落到羧基上，合成因而从C到N端。如果A氨基酸的C端与B氨基酸的N端缩合产生2肽A－B，则A的N端及B的C端必须保护起来，才能转化成在A－B之间形成特异性肽的形式。此外，氨基肽的侧链基团也能与活化羧基反应，因此也必须保护起来。这些侧链保护基团必须能耐受除去α－氨基保护基团的条件，这样才能生成新的氨基基团使肽链得以继续延长。合成结束后必须除去所有的保护性基团以得到所需的多肽。多肽的合成循环包括了一系列的反应，每一循环生成一个新肽键。
　　主要有两个合成策略：片段浓缩法和固相合成法（merrifield法）。片段浓缩法是经典的
合成技术。首先合成数条小肽，经纯化和去保护后结合成较长的肽，直到最后所需的序列。
　　在固相合成法是将肽链一端结合于固相载体上的方法。通过在N－末端逐步加上氨基酸的方法合成肽段。
　　另外也引入一些新进展包括改良的保护基因、新的固相载体、脱保护及侧链功基保护等新方法。在疫苗合成领域中，由于肽链联接或装配到需要的结构（TADPs）及免疫原性构架（MAPs）所用技术的引进，加上肽链经脂质或碳水化合物的修饰作用，使得合成问题变得更加复杂。目前多应用固相法，特别是在选择和确定有效抗原表位研究方面，是合成多肽疫苗的一条可供选择的途径。
　　二、多肽疫苗的生产工艺及质控
　　（一）应提供研制某一疫苗的详细资料，包括选择特定抗原决定簇的理由、对抗原决定簇的检定，以及对载体、表位连接、结合剂、肽的呈递方式及佐剂等的选择理由及其相应证据。
　　（二）应说明每条肽段所针对的抗原表位。内容包括对每个表位来源的说明，当不止一个表位时，应说明把不同表位相互结合到一个已知序列内的理由，此外还应对表位的类型（B、Th、Tc等）及特殊组合方式进行说明。
　　（三）应当提供肽链合成的详细资料。内容包括：原料的来源和特性、使用的方法学、氨基酸的连接和脱保护，进入下一步连接的判断标准，任何加入的修饰基团（例如糖基化，脂质化）的详细情况。如果采用了液体合成法，应当提供包括对中间体有特殊说明的流程图。
　　（四）如果肽单体为中间产物，应当对其分离鉴定并提供下述确证依据。
　　1．主要肽顺序与预期的结构相同，例如，目标氨基酸按需要的顺序排列；修饰（脂化及糖基化）情况；
　　2．对肽单体中的主要杂质（可能情况下对次要杂质）应分离鉴定。验证纯度时应采用多种技术对其理化特性尽可能多地检查，特别要注意检测生产或纯化过程中可能加入的物质；
　　3．连续多批产品的肽质量应保持一致。
　　（五）对肽单体或肽衍生物应建立适当的标准。对肽的纯度、总杂质、每种主要及次要杂质都应规定限度要求。
　　（六）如果不能对肽单体进行全面鉴定，应提供相应说明。
　　（七）应对肽的稳定性进行评价，并制定适当的贮存期。
　　（八）偶联物
偶联物中多肽及其它成分除了达到适当的要求外，还应符合下列规定：
　　1．对偶联物进行验证，其含量应能重复并保持一致，当不止一种肽结合到同一载体上时，应对每一种肽所占比例进行控制并能重复制备；
　　2．最大限度降低副反应并控制到能重复的水平，这些副反应包括载体之间的交联，载体表面浓缩的未结合的偶联剂，以及对未参与结合的偶联剂的灭活等；
　　3．有证据表明偶联物未改变抗原序列；
　　4．应当考虑机体对载体蛋白或其诱导免疫反应的潜在临床影响；
　　5．当同一载体用于几种疫苗或一种疫苗的几种不同表位时，应考虑特异性表位抑制的可能性，并进行调查；
　　6．应当最大限度地降低残余溶剂或副产品的含量，并设定相应限定要求；
　　7．应当设定适宜的可接受的标准，合适的参考制品可能是必要的。
　　（九）载体
　　肽可以联接或结合到载体上，选择载体时应谨慎，因为对载体的免疫应答可能会掩蔽对肽的免疫应答。目标人群中的一部分可能对某一载体存在过敏反应或某些载体有刺激自身免疫的危险，应避免选择这些载体。载体应有自已的档案材料及相应标准，它包括：载体的鉴定，生产一致性的证据，蛋白质的安全性以及与蛋白质、脂多糖、多聚体、脂质体等相关的一些特征试验。例如，聚合体和脂多糖应当具有可重复的分子量范围，脂多糖具有一致的单糖组分，脂质体具有一致的结构、组分。对不同成分及杂质应鉴别定性并加以定量测定，对于生物来源的载体应当采取措施，确保检测不出感染因子。
　　（十）聚合、烷化或载体合成肽
　　无论是与聚合肽构架（例如MAP）结合的肽，或肽单体合成后再进一步形成的聚合肽或烷化肽（例如，通过未端半胱氨酸的氧化作用），也无论是单一肽链或与其它肽链的聚合，都应有相应的证据，表明反应过程达到了最后可重复的阶段。
　　（十一）佐剂、防腐剂及其他添加成分为方便操作、增强稳定性、延长保存期以及修饰免疫原的类型和免疫原性，原则上可在免疫原中选择添加许多成分。这些成分其特性变化较大，从小分子物质到大分子菌体成分及合成聚合物等各不相同，有作为非特异免疫增强剂的成分，特异性免疫激活作用的成分及直接作用于不同免疫细胞的成分。其中许多会产生自身的毒性，而且可能因与抗原联合使用而显著改变免疫反应，从而引起安全性方面的其它顾虑。传统佐剂是在矿物胶基础上制成-氢氧化铝、磷酸铝或磷酸钙，到目前为止批准使用的佐剂鲜为他类。对已获批准的以铝盐及钙盐为基础的佐剂，其标准应达到药用等级（不含重金属离子，质量恒定，具有恒定的结合特征）。由于灭菌可能会改变佐剂的结合特征，对不同批次佐剂应以可重复、持续的方式处理。对于添加剂，应提供所有成分的明确说明，阐述使用的理由。每种成分应具有适当的分析标准要求，终配方中应限定不同成分混合物的含量。此外，应全面评价配方的抗原及毒性特征，特别注意不同成分的混合可能会导致抗原发生不良的修饰作用。
　　如果在疫苗中加入防腐剂，应确定其含量，该用量应既不对疫苗中的各个成分产生不良作用，也不应引起人体副反应。单剂量制剂不应添加防腐剂。
　　（十二）稳定性
　　进行充分的稳定性研究是研制疫苗的一项重要内容。因此应确定配方的稳定性，并以此建立合适贮存条件下的最大货架期。为确保每种成分的有效性，应对到期产品的免疫原性及安全性进行实时稳定性研究。
　　三、产品的质量与检定要求
　　保证多肽制品的一致性极其重要，应广泛使用分析技术。应对疫苗生产工艺的各个环节和步骤的各种成分（无论以单独或偶联方式）均应建立相应的监控标准，包括原材料质控，加工过程的质控和终产品的质控，以保证终产品安全有效。
　　除应符合常规的安全试验（如无菌、热原试验及异常毒性试验），针对合成多肽的特点应考虑：
　　（一）纯度：高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）、阳离子或阴离子色谱、等电聚焦，依据分子大小的鉴别技术（分子筛层析，还原、非还原SDS－PAGE 电泳），根据疏水性的鉴别技术（反相或疏水作用层析）等相应分析的技术。
　　（二）理化性质均一性的确定：氨基酸序列分析（N/C末端）、肽图、MS以及氨基酸组成（AAA）分析。
　　（三）产品相关的杂质
　　（四）与生产过程相关的杂质
　　（五）人为修饰的检测
　　（六）效力试验
　　效力试验并非一定反映出在人体内的作用机制或功能活动。但是在合适情况下应包括有关疫苗功能的适宜试验。效力试验的主要目的是通过测定生物活性的方法，确认各批之间的一致性。因此应考虑活体外及活体内免疫性和抗原性测定试验。这种试验应将制品同时与参考品做比较，而且试验结果经过统计学检验。由于疫苗的作用模式会改变，有关这类试验的细节应区别对待，不能一概而论。但是应确定试验结果的可信限，以便确定方法本身固有的变异，为每批制品的平均值提供一个可信限幅度，并由此确定接受的标准及限值，为此应建立适宜的参考制剂。
　　（七）生物效价测定
　　（八）建立内部参考品：建立适当的参考品对实现这些标准也是必要的。此外，选取合适的一批中间产品及终产品（最好是选择经过临床评价的制品），就其化学成分、纯度及生物学活性进行全面检定，而后保存下来作为化学或生物参考品，可依此制定每批产品的标准要求。
　　（九）佐剂、保护剂及其他添加成分：如果使用铝或钙的化合物作为佐剂，其用量不应超过常规用量范围（每人用剂量的铝佐剂含量应不超过1.25mg，钙佐剂含量应不超过1.3mg）。对保护剂及其他添加剂应确定相应的质量控制标准。
　　四、临床前安全评价
　　临床前安全评价的主要目的是确定新药制品是否引起意外或不良的效应。但推荐供化学药使用的临床安全及毒性试验对于合成肽疫苗不甚相关。动物毒性试验会产生种属特异性方面的问题，因此，多肽疫苗的安全评价应考虑诸多因素。有必要采取灵活的方法评价合成肽疫苗的临床前安全性，应当充分考虑使用合成肽疫苗所产生不良免疫病理反应的各种可能性。
　　必须确保使用的肽序列不具有明显的不良药理活性。因此，应筛查单体肽固有的毒性或药理作用。也应考虑由聚合或偶合而产生的作用的可能性。一种多肽可能有意想不到的次要活性，而这一活性可能会由于上述反应而得到放大并产生危害。因此，应全面检查多肽及其偶合物的药理活性。
　　抗肽抗体可能与人体组织产生意想不到的交叉反应，也可引发自身免疫反应。因此，应使用人体组织测定疫苗的最后配方及佐剂是否产生意外的交叉抗体。偶合或聚合反应能产生新的表位，而仅仅评价肽单体不能解决该问题。毫无疑问安全试验是必要的，但选择何种试验则应依靠实际情况而定，并应咨询有关质控当局。对于临床前安全性试验，应广泛使用生物学、生物化学、免疫学、毒理学及组织病理学等适当的研究技术，在适当的情况下，可采用多个相关剂量并包括急性及慢性试验。

结合疫苗质量控制和临床研究技术指导原则

前　　言
　　结合（以蛋白为载体的细菌多糖类）疫苗是指采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上所制备成的多糖-蛋白结合疫苗，用于提高细菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血杆菌结合疫苗、脑膜炎球菌结合疫苗和肺炎球菌结合疫苗等。结合疫苗的生产及质量控制应符合国家有关规定和中国药品GMP要求。其制造及检定方法的标准操作规范、验证和修订应获得国家食品药品监督管理局的批准或认可。
　　本原则适用于多糖-蛋白结合疫苗生产的质量控制和临床研究。
　　应根据疫苗生产用菌种的生物安全防护等级分类，在相应的生物安全防护条件下进行各项生产用菌种的操作。生产操作和质量检验人员必须经过严格的职业培训，并应采取适宜的防护措施，例如免疫接种相应的疫苗。必须制订详细的和切实可行的紧急处理措施，确保一旦发生细菌溢出、渗漏等其它细菌播散事故时，可最大限度地控制和避免危害人身和环境的安全。
　　一、结合疫苗生产的质量控制原则
　　（一）多糖抗原生产的质量控制
　　1．生产用菌种和培养基：生产用菌种须经国家食品药品管理当局批准方可用于制备多糖抗原。应采用种子批系统。从原始种子批传代、扩增后冻干保存为主种子批。从主种子批制备工作种子批。主种子批和工作种子批菌种的各种特性应与原始种子批一致。工作种子批用于生产。应验明各级菌种库菌种的记录、来源、历史和生物学特性，并进行各项必需的生物学特性鉴定。如：形态、培养特性、生化反应和血清学试验等。必要时可采用核磁共振（1H或13C）、核苷酸序列分析等特殊鉴定方法。
　　培养基成分应尽可能避免使用动物源性材料，禁止使用来自疯牛病疫区的牛源性材料。
应通过监测细菌的生长速度、pH值和多糖的产量，保证不同批或不同培养罐中细菌生长的均一性。
　　应在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌试验，可采用革兰氏染色镜检和平皿划线接种培养等。若发现染有杂菌应废弃。
　　2．精制纯化多糖：精制纯化多糖应逐批进行鉴别试验、纯度和分子大小测定。应制定多糖纯度的合格标准。通常应在－20℃以下储存精制纯化后的多糖，以维持其稳定性。为控制精制纯化多糖的质量所进行的测定包括：
　　（1）鉴别试验：通常应用血清学反应进行多糖鉴别试验；
　　（2）分子大小分布：应采用凝胶过滤或高效液相色谱（HPLC）等适宜方法测定纯化多糖的分子大小分布，并建立相应的KD 值合格标准，不同批纯化多糖的KD 值应保持一致；
　　（3）采用冻干保存的纯化多糖,其水分含量应合格；
　　（4）多糖含量：应采用特定的方法测定糖含量，如磷含量测定、唾液酸含量测定和核糖含量测定等方法；
　　（5）杂蛋白含量：应采用Lowry 法、BCA法等方法测定纯化多糖中蛋白杂质的含量，应同时采用相应的国家标准品作蛋白测定对照；
　　（6）核酸杂质含量：应采用紫外260nm测定等方法测定纯化多糖中核酸杂质含量；
　　（7）应采用家兔热原试验或鲎试验定量测定方法测定纯化多糖中的热原质及内毒素含量；
　　3．修饰处理后的多糖：多糖与载体蛋白结合前通常需先经化学修饰，即活化（例如可采用溴化氰活化多糖）。应采用适宜的方法检测化学修饰的效果, 即活化度测定；另外，可采用凝胶过滤或高效液相色谱等适宜方法测定活化后多糖的分子大小分布，以确保多糖－蛋白结合反应的批间一致性。
　　（二）载体蛋白的质量控制
　　载体蛋白生产用菌种和培养基的质控原则与多糖抗原生产用菌种和培养基的质控原则相同。
　　结合疫苗常用的载体蛋白包括有：破伤风类毒素、白喉毒素无毒变异蛋白（CRM197）和B群脑膜炎球菌外膜蛋白等。
　　如果采用已有国家标准的破伤风类毒素和白喉类毒素等作为载体，其各项质量指标应符合现行版《中国药典》的要求，尤其要注意确保载体蛋白的纯度。
　　采用国外已通过临床试验验证的安全有效的CRM197 蛋白、B群脑膜炎球菌外膜蛋白等作为载体，应参照国外相应的质量标准，对其特性和纯度进行质量复核：（1）可采用HPLC法等适宜方法测定CRM197 蛋白的纯度，其纯度应在90% 以上；应确保CRM197 蛋白的氨基酸序列正确无误。如果与白喉类毒素在同一车间生产，应建立能区分CRM197 蛋白和白喉毒素的方法，并应符合中国药品GMP要求。（2）可采用SDS-PAGE 图谱分析测定纯化后B群脑膜炎球菌外膜蛋白复合物的组成；其脂多糖的含量不应超过8%；家兔热原试验应合格。
　　采用上述以外的其它蛋白作为载体，应参照上述蛋白载体质量标准要求，结合其自身特点建立相应的质量标准，并进行严格的质量检测和复核。
　　可采用血清学方法进行载体蛋白的鉴别试验。用于检测载体蛋白理化特性的常用方法包括：SDS-PAGE 图谱分析、等电聚焦分析、HPLC测定、氨基酸分析、氨基酸序列分析、旋光度测定、荧光分光光谱分析、肽图谱分析和质谱分析等。
　　如果载体蛋白与多糖结合前需进行活化处理，应建立测定蛋白活化程度的方法，以确保批与批之间的一致性。
　　（三）多糖-蛋白结合物原液的质量控制
　　不同的结合疫苗可能采用不同的多糖-蛋白结合工艺，但均需要进行多步反应。为了确保多糖-蛋白结合物的稳定性、安全性和批间一致性，应建立相应的质量控制方法。由于结合反应可能影响多糖的结构，多糖-蛋白结合后（单价结合物未混合前）应进行多糖的鉴别试验。此外，还应对纯化后的多糖-蛋白结合物进行以下检测：
　　1．应采用适宜的检测方法，确证多糖-蛋白结合物原液经过纯化后，多糖-蛋白结合反应中所使用的试剂（如溴化氰、ADH和EDAC等化学试剂）已被清除；
　　2．如果化学结合反应产生了独特的结合标志（例如某一独特的氨基酸），可通过测定该标志物定量分析多糖—蛋白结合反应的程度，也可将结合物中多糖/蛋白比作为判断结合反应的一个间接标志；
　　3．残留的活化功能基团：结合物中多糖或载体蛋白均应不再残留有活化后未结合的功能基团；
　　4．结合及未被结合的多糖含量：结合多糖为结合疫苗中的免疫保护抗原。未被结合的游离多糖不得超过一定比例。可直接测定游离多糖的含量，或先将结合多糖和未结合多糖分离后测定结合多糖的含量。将结合多糖和游离多糖分离的方法包括沉淀、凝胶过滤、超滤或超离等方法；
　　5．蛋白含量：可采用HPLC等适宜方法测定多糖-蛋白结合物中结合蛋白和未结合蛋白的含量；
　　6．多糖/蛋白比：分别测定结合物中结合多糖和结合蛋白的含量；
　　7．分子大小分布：结合物原液应逐批进行相对分子大小的测定，可采用凝胶过滤或液相色谱等方法进行测定，所建立的方法应能将多糖-蛋白结合物与未结合的多糖、蛋白区分开；
　　8．无菌试验应合格；
　　9．结合物中载体蛋白的毒性试验：如果采用破伤风类毒素和白喉类毒素作为载体蛋白，应按现行版《 中国药典》的要求，对多糖-蛋白结合物进行破伤风类毒素和白喉类毒素的毒性试验；
　　10．可对结合物进行热原试验及内毒素含量测定。
　　疫苗原液在稀释、分装前可加入适宜和适量的佐剂、防腐剂及保护剂。多价结合疫苗既可在各单价结合物原液混合后加入佐剂、防腐剂及保护剂，也可在各单价结合物原液中加入佐剂、防腐剂及保护剂后再混合。稀释分装前无菌试验应合格。
　　（五）成品的质量检定
　　1．鉴别试验：通常采用多糖的特异性抗体进行免疫学测定；
　　2．无菌试验：成品中不得检出细菌或真菌等微生物；
　　3．多糖含量：可采用化学显色、色谱分析（包括HPLC）或符合国家规定的免疫学方法（例如速率比浊法或ELISA）进行测定；
　　4．残留水分：如果结合疫苗为冻干制品，应采用适宜方法测定水分，残余水分应不超
　　5．毒素含量：可采用家兔热原试验或鲎试验定量测定内毒素含量；
　　6．佐剂含量：如果疫苗使用了佐剂，应采用适宜的方法检测成品中佐剂的含量，所使用的佐剂及其用量应符合国家有关规定。如果所使用的佐剂为铝佐剂，每人用剂量中的佐剂含量应不超过1.25mg；
　　7．防腐剂含量：选择防腐剂时应该考虑防腐剂的稳定性，应避免选择可能与疫苗成分产生相互作用的防腐剂。如果疫苗中加入了防腐剂，应采用符合国家规定的方法测定成品中防腐剂的含量。所加入的防腐剂及其含量应符合国家有关规定，即应不破坏疫苗的免疫效果，也
不会损害人体健康；
　　8．异常毒性试验，应符合现行版《 中国药典》的要求；
　　9．pH值测定：pH值对结合疫苗的稳定性、安全性及免疫保护效果影响很大，应根据临床研究和稳定性试验的结果确定最适pH值范围。成品应逐批进行pH值测定，冻干制品应采用批准的稀释剂复溶后进行pH值测定；
　　10．外观检查应符合规定要求；
　　11．稀释剂：应对复溶疫苗用稀释剂进行检定。必须采用疫苗生产厂家提供的、符合国家规定的稀释剂。
　　（六）其他
　　结合疫苗的包装、标签、配送、运输和储存均应符合中国药品GMP要求及国家有关规定。
　　结合疫苗的标签上应标明：每一人用剂量中所含多糖抗原（血清群、型别）和载体蛋白；每一人用剂量中每一结合物的含量；储存和运输的适宜温度（2-8℃）；如果疫苗为冻干疫苗，应标明疫苗复溶后应迅速接种；冻干疫苗应标明疫苗复溶所采用的稀释剂名称及体积。稳定性试验应考虑的因素包括：结合疫苗逐渐解聚的特性，导致多糖分子量变小、与蛋白载体结合的多糖含量减少、结合物分子变小以及游离多糖含量增加。加速稳定性试验的结果不能替代实时稳定性试验。如果生产工艺的改变可能影响产品的稳定性，应进行稳定性试验对新方法进行验证。
　　二、结合疫苗的临床研究
　　为评价结合疫苗的安全性和免疫原性，应按国家规定的要求进行结合疫苗的临床研究。由于结合疫苗（尤其是多价结合疫苗）生产工艺相对复杂，影响因素较多，出现批间差异的可能性相对较大。因此，多价结合疫苗宜采用多批疫苗进行临床研究。如果生产工艺发生重大改变，或是将多价疫苗作为一种新联合疫苗的组分时，应考虑重新进行临床研究。
　　如果结合疫苗的生产工艺或剂量、剂型发生了变化，应及时向国家食品药品监督管理局报告，由国家食品药品监督管理局根据具体情况组织专家进行再评估，评估的内容包括：发生的变化是否会影响结合疫苗的质量、批间一致性、结构完整性和免疫原性。应考虑到多个细微改变可能产生的累积效应。
　　必要时，结合疫苗的临床研究中可设置多糖疫苗对照组。如果偶联疫苗的适应证包括载体蛋白来源细菌所导致的疾病，可设置载体菌疫苗对照组。
　　应采用适宜的血清学标准评估结合疫苗的免疫保护效果，应对测定IgG抗体所采用的方法进行标准化，从而验证其功能抗体与IgG抗体的相关性，此外，还可通过临床研究，证明结合疫苗能诱导多糖疫苗无法诱导的免疫记忆反应。

预防用疫苗临床试验不良反应分级标准指导原则

前　　言
　　疫苗系一类特殊的药品，通常用于健康人群的预防疾病。大多数预防性疫苗的各阶段临床试验均选择健康的受试者，并且多数疫苗用于健康儿童，因此，在预防性疫苗临床研究过程中，对安全性方面的考虑尤为重要，其要求应高于一般治疗性药物。
　　标准化的不良反应评价分级标准，已逐渐被广泛用于评估治疗用药物在特定疾病的患者人群中的安全性，但这些分级标准适用于患者，本身的疾病过程经历了轻度、中度或重度临床和实验室指标异常的不良事件，故其参数可能并不适于健康志愿者。本指导原则针对预防性疫苗制定不良反应分级标准的目的，就是最大程度地降低健康受试者在临床试验中的风险，本不良反应分级标准中所采用参数的界定值，系基于已上市疫苗临床试验中所获得的经验和已公开的信息，并结合当前国情的考虑。
　　一、概述
　　本指导原则适于创新性预防性疫苗，并适用于临床试验的受试者为健康成人及青少年时，对试验中发生的临床和实验室指标异常的严重程度即不良反应强度进行评估，并可作为一般预防性疫苗临床试验设计中规定的破盲标准，以及作为是否停止临床研究的参考。同时，本指导原则提供的统一不良反应分级标准也有助于预防性疫苗的同一临床试验不同试验组间或不同临床试验间的安全性数据的比较。
　　预防性疫苗的临床试验应严格遵守《药物临床试验质量管理规范》（GCP）并符合相关的法规要求，管理法规要求疫苗临床研究中发生的不良事件需接受有关管理当局的监查和相关主体（注册申请人、伦理委员会和研究人员）的监控，并适时备报。
　　预防性疫苗的临床试验研究者必须适时、全面、客观而准确地记录所有安全性观察值及相关数据，从而进行不良事件或不良反应的评价，注册申请人必须监测临床研究的全程进展，本不良反应的分级标准有助于进行安全性监控，并及时做出判断和按要求适时报告。
　　本指导原则及已发布的疫苗临床试验相关指导原则的目的旨在为预防性疫苗进行临床试验的安全性评估时提供参考，本文中不良反应的分类和分级标准为临床研究中安全性资料的完整性提供补充。
　　二、基本内容
　　本指导原则提供的预防性疫苗临床试验中不良反应的分级指标包括两部分（详见毒性分级表），第一部分为临床指标（局部反应、全身反应、生命体征检测）；第二部分为实验室指标（血生化、血常规、尿常规检测），但并非涵盖所有预防性疫苗临床试验中所需观察的安全性指标，对于一些开发中的特殊疫苗可能需要增加额外的监控指标，或修改表中参数的具体界定值。例如，额外的参数基于临床前毒理研究的安全性提示或先前类似已上市产品的经验。
　　不同疫苗在进行临床试验时，可根据疫苗的特性，从本文的不良反应分级表中选择适合的观察指标。根据疫苗的各自特征和疾病流行情况，进行合理的安全性监测与评价。
　　（一）不良反应分级表
　　1．临床观察指标（表1～3）

表1 局部反应分级表

局部反应

轻度（1级）

中度（2级）

严重（3级）

潜在的生命危胁（4级）

疼痛

不影响活动

影响活动或多次使用非麻醉性止痛药

影响日常活动或多次使用麻醉性止痛药

急诊或住院

皮肤粘膜

红，瘙痒

弥散，斑丘疹样皮疹，干，脱屑

泡状，潮湿，脱屑或溃疡

脱皮性皮炎，累及粘膜，或多型性红斑，或疑似Stevens-Johnsons综合症

硬结*

<15 mm

15～30 mm

>30 mm

坏疽或剥脱性皮炎

红*

<15 mm

15～30 mm

>30 mm

坏疽或剥脱性皮炎

肿**

<15 mm且不影响活动

15～30 mm或影响活动

>30 mm或限制日常活动

坏疽

疹（注射部位）

<15 mm

15～30 mm

>30 mm

瘙痒

注射部位微痒

注射肢中度痒

全身痒

*除了最直接地通过测量直径来分级评价局部反应，还要记录测量结果的发展变化。

**肿的评价和分级应根据功能等级和实际测量结果

表2 生命体征分级表

生命体征*

轻度（1级）

中度（2级）

严重（3级）

潜在的生命危胁（4级）

发热，腋温*

37.1～37.5℃

37.6～39.0℃

>39.0℃

口温**

37.7～38.5

38.6～39.5℃

39.6～40.5℃

＞40℃

心动过速（次/min）

101～115

116～130

>130

由于心率不齐就急诊或住院

心动过缓（次/min）

50～54

45～49

<45

由于心率不齐就急诊或住院

高血压（收缩压mmHg）***

141～150

151～155

>155

由于严重高血压就急诊或住院

高血压（舒张压mmHg）***

91～95

96～100

>100

由于严重高血压就急诊或住院

低血压（收缩压）mmHg***

85～89

80～84

<80

由于低血压休克就急诊或住院

呼吸频率（次/min）

17～20

21～25

>25

需气管插管

* 引自中国预防接种手册，受试者应在静止状态进行检测

** 口温；检测前没有喝热的或冷的饮料或吸烟

*** 血压异常的判断需与使用疫苗前的基线血压值对比，进行具体分析。

表3 全身反应分级表

全身反应

轻度（1级）

中度（2级）

严重（3级）

潜在的生命危胁（4级）

变态反应

瘙痒无皮疹

局部荨麻疹

广泛荨麻疹，血管性水肿

严重变态反应

头痛

不影响活动，无需治疗

一过性，稍有影响活动，需治疗（多次使用非麻醉性止痛药）

严重影响日常活动，初始麻醉剂治疗有反应

顽固性，重复麻醉剂治疗。急诊或住院

疲劳、乏力

正常活动减弱＜48小时，不影响活动

正常活动减弱20%～50%＞48小时，稍影响活动

正常活动减弱＞50%，严重影响日常活动，不能工作

不能自理，急诊或住院

恶心、呕吐

1～2次/24小时，摄入基本正常且不影响活动

2～5次/24小时，摄入显著降低，或活动受限

24小时内＞6次，无明显摄入，需静脉输液

由于低血压休克需要住院或其他途径营养

腹泻

轻微或一过性，2～3次稀便/天，或轻微腹泻持续小于1周

中度或持续性，4～5次/天，或腹泻＞1周

＞6次水样便/天，或血样腹泻，直立性低血压，电解质失衡，需静脉输液＞2L

低血压休克，需住院治疗

肌肉痛

不影响日常活动

非注射部位肌肉触痛，稍影响日常活动

重度肌肉触痛，严重影响日常活动

症状明显，肌肉坏死，急诊或住院

咳嗽

一过性，无需治疗

持续咳嗽，治疗有效

阵发咳嗽，治疗无法控制

急诊或住院

其它不适或临床上的不良反应(依据相应的判断标准)

不影响活动

稍有影响活动不需药物治疗

严重影响日常活动需要药物治疗

2、实验室指标(表4～6)

由于实验室所有指标作为参考标准须依据所规定的正常值而定, 因此需提供规定的正常值范围来证明其合理可行性，以下仅供参考。

表4 血生化指标分级表

血清

轻度（1级）

中度（2级）

严重（3级）

潜在的生命危胁（4级）

肝功能－ALT,AST由影响因素引起的升高

1.25～2.5 ×ULN*

2.6～5

×ULN

5.1～10

×ULN

>10×ULN

肌酐

1.1～1.5×ULN

1.6～3.0×ULN

3.1～6×ULN

>6×ULN

BUN

1.25～2.5×ULN

2.6～5×ULN

5.1～10×ULN

>10×ULN

胆红素:由影响因素引起的升高但功能检查正常

1.1～1.5×ULN

1.6～2.0×ULN

2.0～3.0×ULN

>3.0×ULN

胆红素:由影响因素引起的升高伴随肝功能检查指标的升高

1.1～1.25×ULN

1.26～1.5×ULN

1.51～1.75×ULN

>1.75×ULN

胰酶-淀粉酶，脂肪酶

1.1～1.5×ULN

1.6～2.0×ULN

2.1～5.0×ULN

>5.0×ULN

CPK-mg/dL

1.25～1.5×ULN

1.6～3.0×ULN

3.1～10×ULN

>10×ULN

*“ULN”：为正常值范围之上限

#在毒性评价和结论中的临床症状需与每项实验室参数共同描述，并在研究中进行监查

表5 血液检查分级表

血液

轻度（1级）

中度（2级）

严重（3级）

潜在的生命危胁（4级）

血红蛋白（女性）（g/dL）

12.0～13.0

10.0～11.9

8.0～9.9

<8.0

血红蛋白（女性）与试验前比较的变化（gm/dL）

增长～1.5

1.6～2.0

2.1～5.0

>5.0

血红蛋白（男性）（gm/dL）

12.5～14.5

10.5～12.4

8.5～10.4

<8.5

血红蛋白（男性）与试验前比较的变化（gm/dL）

增长～1.5

1.6～2.0

2.1～5.0

>5.0

白细胞升高

（个/mm3）

>13,000/mm3

13,000～15,000/mm3

15,000～30,000/mm3

>30,000

白细胞降低

（个/mm3）

2500～3500

1500～2499

1000～1499

<1000

凝血时间－由影响因素引起的延长

1.0～1.10×ULN

1.11～1.20×ULN

1.21～1.25×ULN

>1.25×ULN

局部促凝血酶原激酶时间－由影响因素引起的延长

1.0～1.2×ULN

1.21～1.4×ULN

1.41～1.5×ULN

>1.5×ULN

**“ULN”：为正常值范围之上限

表6 尿液检查分级表

尿

轻度（1级）

中度（2级）

严重（3级）

潜在的生命危胁（4级）

蛋白

微量

1+

2+

>2+

尿糖

微量

1+

2+

>2+

血细胞（镜检）

每个高倍视野下的红细胞数（rbc/hpf）

1～10

11～50

>50或/和密布血细胞

住院治疗或需输入浓缩血细胞
　　

以上表中的分级指标并不推荐用于所有疫苗临床试验的健康志愿者的安全性监测，也不代表涵盖了所有安全性的监测指标，建议选取适宜的监测指标用于相应的预防性疫苗的临床试验受试者。
　　鉴于健康婴幼儿的部分生理指标与成人明显不同，建议在具体应用时结合临床研究的具体情况进行相应的调整。
　　（二）不良反应强度分级的一般评估原则
　　对于上面分级表中未涉及的临床异常情况，按照下列标准对不良反应进行强度分级评估：
　　1级　轻度　短时间的不适（＜48小时），无需医疗；
　　2级　中度　轻度到中度限制日常活动，不需要或只需要少量的医疗干预；
　　3级　重度　显著地限制日常活动，需要日常生活照顾，需要医疗，可能需要住院；
　　4级　危及生命　极度限制日常活动，显著地需要日常生活照顾，需要医疗和住院；
　　（三）严重的或危及生命的不良反应
　　预防性疫苗的临床研究中，发生由临床医师认定的任何严重的或危及生命的临床事件，其强度均被认为是4级，包括：癫痫、昏迷、手足抽搐、糖尿病酮酸中毒、弥散性血管内凝血、弥散性瘀斑、麻痹或瘫痪、急性精神病、严重抑郁症等。
　　严重的或罕见的不良反应常需要大量样本的临床研究才能发现，有时可能需通过上市后进行进一步评价。但在上市前的临床研究中，应尽可能的增大样本量，以期发现少见或罕见的严重不良反应。而作为主要适用人群为健康个体并包括婴幼儿的疫苗而言，对其安全性的要求较其他药品更为严格，考虑更为慎重。如在必要的情况下，还可进行以安全性观察指标作为临床评价终点的临床研究，样本量最低则需符合统计学的要求。
　　国家食品药品监督管理局将根据预防性疫苗临床研究的情况，适时对本指导原则进行修订和完善。