第三节　肿瘤坏死因子的检测

一、生物学检测法

TNF的主要生物学活性之一就是对某些肿瘤细胞的细胞毒作用。根据这一特点，可利用TNF敏感的靶细胞测定TNF活性，根据细胞死亡得出TNF的相对活性。该法的关键是选择敏感特异的靶细胞。靶细胞可以是长期传代培养的细胞系，也可以是新鲜分离的原代细胞（如瘤细胞）。现以贴壁生长的L929细胞为例，简述TNF活性的检测原则。

两种TNF均可伤体外培养的L929细胞，细胞死亡率与TNF活性成正比。某些染料如中性红、结晶紫等能使活细胞染上相应颜色，再用脱色液将染料脱出，通过测定其吸亮度值间接监没细胞存活状态。

试验原则是收集对数生长期的L929细胞，用培养液调细胞至适当浓度，加入培养板小孔中，置37℃，5％CO₂温箱中培养16～24h，换液后，在各孔中加入不同稀释度的待检样品，再加适当浓度的放线菌素D和适量培养液，继续温育16～24h，弃培养液，经Hanks液洗涤后，每孔加入适当浓度的结晶紫染色液，37℃培养1h，使活细胞充分着色。然后各孔加1％SDS短时温育使染色细胞溶解，再以酶标测定仪测各孔A_570nm值。每次检测均设培养液（阴性）对照和不同浓度的rTNF（阴性）对照。以使阴性对照50％细胞溶解的标本最大稀释倍数为TNF活性单位，以u/ml表示。

由于放线菌素D能抑制DNA的合成、降低靶细胞对损伤的修复机制，因而在检测中加入放线素D可使靶细胞对TNF的敏感性增高10～200倍。

二、免疫学检测法

通常采用ELISA，该法特异性高、敏感性强且快速使捷，而且能够区别TNFα和TNFβ，为临床检测病人血清中TNF水平的有效方法，但不能反映TNF活性。

三、其它检测法

检测TNF还可用生物发光法及NAG微量酶反应比色法。这类方法是应用生化技术检测细胞内代谢的变化，从而推知靶细胞功能变化及死亡情况。其优点是不仅反映细胞的死亡情况，而且能反映细胞的功能变化。此外，还具有快速、方便、微量的特点。