第五节　寡核苷酸探针的制备

利用寡核苷酸自动合成仪，可很简单地合成制备寡核苷酸探针（如15～50bp），这类探针具有以下优点：①短的探针比长探针杂交速度快，特异性强。②可以在短时间内大量制备。③在合成中进行标记制成探针。④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。

因此，寡核苷酸探针的研究，对于提高核酸杂交技术的特异性和敏感性，扩大应用范围有重要意义。

常用的寡核苷酸探针有3种：①特定序列的单一寡核苷酸探针；②较短的简并性较高的成套寡核苷酸探针；③较长而简并性较低的成套寡核苷酸探针。多用³²P标记寡核苷酸探针，如：1）通过T₄噬菌体多核苷酸激酶催化的磷酸化反应标记合成的寡核苷酸探针，在合成寡核苷酸时期5’端缺少一个磷酸基，因而易用T₄噬菌体多核苷酸激酶进行磷酸化反应，而将α-³²P从[γ-³²P]ATP转移至其5’端。这种磷酸化反应最多能使每一寡核苷酸分子中掺入一个³²P原子。2）用大肠杆菌DNA聚合酶i Klenow片段标记合成的寡核苷酸探针，其比活性更高，每一寡核苷酸分子可带有若干个放射性原子，放射性比活度可高达2×10¹⁰计数/（min·mg）。

附图 DNA聚合酶i Klenow片段标记合成寡核苷酸探针

寡核苷酸探针的非放射性标记时，可用以下几种方法：

1．酶延伸法合成与探针目的基因的3’-端一段互补的寡核苷核序列，此序列的5’-端多加一个A，与目的基因片段退火，再用Klenow酶延伸，使bio –dUTP掺入探针的3’末端。

2．5’磷酸末端标记法带5’-磷酸的寡核苷酸探针，在咪唑缓冲液中用水溶性碳二亚胺（EDC）处理，可生成活性的磷酸咪唑中间体，与过量的乙二胺作用，就可以引入一个带氨基的接臂。用活化生物素标记就可以得到5’-磷酸标记的寡核苷酸探针。

3．酶标探针法用双功能联接剂如辛二酸双羟基琥珀亚胺酯联接寡核苷酸和碱磷酶，可以生成1：1的酶标寡核苷酸探针。此法省略了生物素-亲合素中间步骤，可减少非特异性反应。

4．生物素酰肼胞嘧啶修饰法在亚硫酸盐催化下，生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基而得生物素化寡核苷酸探针。

5．寡核苷酸的酶促加尾标记法在末端转移酶的作用下，用非放射性物质修饰的核苷酸（生物素dATP；生物素-dUTP；地高辛-dUTP）可加到DNA的3’末端，每个探针DNA可加上10～20个修饰碱基。

（1）取-0.5ml硅化塑料离心管，插入冰浴中，加入寡核苷酸（3pmol）×μl，5×加尾缓冲液20μl，5.0mmol/l dUTP 4μl（终浓度200μmol/L），修饰的dNTP（生物素-dUTP；生物素-dATP；地高辛-dUTP）×μl（终浓度100μmol/L），加入至100μl，混匀后加入末端转移酶5u。37℃反应1h。

（2）探针纯化：乙醇沉淀法：加入50μg tRNA，15ul 4mol/L醋酸钠和375μl无水乙醇，混匀，-20℃1h，高速离心10min，弃上清，用70%乙醇和无水乙醇再反复洗沉淀，晾干，再溶于水中，浓度为500ng/ml。

常用试剂配制方法[见附录二“（四）关于探针的标记”部分]。