第五节　原位杂交免疫细胞化学技术的未来与展望

自1969年以来，我们高兴的看到原位杂交免疫细胞化学技术已从分子生物学的一个分支发展成为生命科学的有效的研究方法。在原位杂交免疫细胞化学发展过程中两个关键性的突破是核酸探针制备的标记物的改进。核酸探针由克隆的核酸探针发展到无克隆的合成的寡核苷酸探针；从放射性同位素标记到非放射性标记。令人可喜的是，这一技术还处于不断的改进和更新的过程中。

一、PCR与原位杂交细胞化学结合法

自1988年以来On等科学家相继在研究对导致人类免疫缺陷的HIV-1/AIDS病毒DNA进行细胞内定位，以期提高对患者的阳性检出率。在系列研究的基础上，Bagasra及其同事在1990～1993年成功的报告了原位杂交及聚合酶链反应结合法，简称为原位杂交PCR（PCr in situ, PCRIS）。在本书二十二章　中曾介绍了PCR技术，它是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的无细胞克隆技术，基本步骤包括高温变性，低温退火适温延伸三个步骤的反复热循环，其效率可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增10⁷～10⁹倍。大大提高了DNA的检测率。此法不足之外，在于其不能达到细胞或组织的定位。PCRIS技术的基本的原理是首先利用PCR技术将靶DNA片段扩增，然后用原位杂交细胞或免疫细胞化学技术通过标记的核酸探针与扩增了的DNA进行杂交显示和定位，其敏感性可达到显示单个拷贝基因的信号的程度。Bagasra及其同事们利用这一方法，应用³²P和生物素标记的核酸探针分别对导致人体免疫缺陷的HIV-1/AIDS病毒DNA的单个拷贝基因经PCR扩增后在外周血单核细胞内显示成功。就算此法对HIV-1感染患者外周血单核细胞检测的阳性率明显高于用单纯原位杂交技术的检出率，说明其敏感度大于单纯的原位杂交免疫细胞化学技术。其主要实验步骤为将离心沉淀的细胞滴入覆有聚四氟乙烯（teflon coated）的设有三个凹孔的特制玻片（CellLine Associ－ates,Newfield, NJ ,Cat No 10～ 12,12～14mm的孔）的凹孔内，加热105℃90s，然后以2%多聚甲醛-磷酸缓冲液，pH7.4，固定1h，PBS漂洗3min×3。如用生物素标记核酸探针，应用0.3%的H₂O₂孵育37℃过夜，然后以蛋白酶K溶液（5μg/ml PBS）55℃孵育2h（孵育时间应根据细胞的种类而定），将孵育的载片置于96℃热板上2min，最终以蒸馏水漂洗，空气干燥。在溶液中按PCR技术的需要加入20PM一对应的引物（Primer），15μg PCR混合液含10μmol/l dATP、dCTP、dGTP和dTTP、50mmol/l KCl,10mmol/L Tris(pH8.3),2.5mmol/LMgCl₂和10μl Taq多聚酶（lu/μl,Gene Amp Cetuo）。把上述溶液加入左侧二孔中，留一孔加入无引物的PCR混合液作为对照。将载片以22×66mm盖片覆盖，片周以无色指甲油封闭，放入自动的热循环仪（M.J.Re－seasCH,Boston MA）。可改良用铝锡箔纸覆盖于热循环仪表面再放置载片。按94℃/45℃/72℃每个温度1min，30个循环。这温度也可根据引物的GC比例加以调整以求得理想的扩增。也可根据下列公式计算引物的Tm值（Muller & Wold,1989）。

引物Tm=81.5 + 16.6(logM) + 0.41(%GC)–500/n

n=引物的长度，mol/L=缓冲液中盐的摩尔数，一般是0.047mol./L

按扩增后，将切片放入100%乙醇3～5min，以锐利刀片移除盖片，将载片放在90℃热板上30s，应用2×SSC漂洗，然后用生物素标记核酸探针进行杂交。载片在95℃热板上5min，然后移入温盒，48℃孵育4h或过夜。次日PBS漂洗，以抗生物素标记FITC抗血清（100μg/ml PBS pH7.2）37℃孵育1h，PBS冲洗，以甘油/PBS溶液封片，荧光显微镜观察。如生物素标记核酸探针的显示系统为过氧化物酶，则应用DAB/H₂O₂溶液显色，常规光镜观察。这一技术不仅提高了病毒HIV-1的侦检率，而且可用以确定细胞内携带的特殊基因，遗传片段，病毒和肿瘤的侵犯（load）等，是一项颇具广阔应用前景的实验技术。

二、快速原位杂交细胞化学技术

原位杂交免疫细胞化学技术存在的难点之一是实验手续繁琐，实验周期长。国外Liesi等（1986）和国内学者何彬等应用光敏生物素-链亲合素（Biotin-streptavidin）胶体金系统进行原位杂交，得到了快速满意的结果，全部实验可在数小时内完成。

作用把含某种多肽或蛋白的cDNA片段的质粒，按照第十九章　在光照下标记光敏生物素，然后经DNA酶消化1h，得到大量100～500bp长度的混合片段，变性后用于原位杂交。

如为培养细胞或细胞涂片，用95%乙醇、5%乙醇固定5min，PBS冲去固定液，加含探针的杂交液覆盖（光敏生物素标记探针浓度为2.5ng/μl），在温盒中50℃孵育1～2h，取出后直接加入胶体金标记链亲合素（1mg/ml）室温孵育15min，然后在室温或37℃下用大容量（200ml/每片）洗脱液（2×SSC，0.1%Triton X-100）分别冲洗5～10min，以银显影液放大金颗粒显示原位杂交结果，可用1%伊红复染，脱水，透明，封片，镜检。

如为冰冻切片（cryostat section 10～15μm），应经新鲜配制4%多聚甲醛室温固定15min，PBS冲去固定液，吸干后滴加蛋白酶K（25μg/ml,Sigma）37℃15min，再用4%多聚甲醛室温固定20min，PBS冲去多聚甲醛，晾干后按上述方法进行原位杂交和杂交后冲洗。

三、原位启动标记法

原位启动标记法（Primed in situ labelling,PRINS），又叫寡核苷酸启动法（Oligonucleotide－priming method）是Koch（1987）首先提出的，其基本原理是将未标记的寡核苷酸探针与细胞或组织中的靶DNA或RNA进行杂交，然后该寡核苷酸探针充当引物的作用，在Kelow多聚合酶的催化作用下，将生物素（或地高辛、荧光素）标记的核苷酸编入，以达到原位显示的目的。PRINS技术具有3个方面的优点：首先由于探针在杂交时是未标记的，仅在杂交之后才进行标记，因此背景染色很低。至少，从理论上讲，背景染色几乎是零。其次是有效地缩短了实验的时间，由于探针未经标记，无增加背景染色的顾虑。因此，可增加探针尝试，缩短反应时间。杂交反应时间只需1h。实验反应时间的缩短可有效的保持细胞或组织结构的完整性。第三个优点是能提高或增加信号的强度。Koch等曾成功的将此方法应用于染色体制片、单层细胞涂片和组织切片。它们还将此法与流式细胞计相结合以达到检测群体离散细胞的目的。

在染色体或单层细胞涂片，载片在70℃的溶液中变性（70%甲酰胺，2×SSC）2min，立即在系统酒精中脱水（70%，80%，90%，95%,100%，V/V），用吹风机吹干。预孵育在37℃～53℃20～30min，孵育时间加盖玻片，孵育液含2～4pmol寡核苷酸探针，dATP，dCTP，dGTP各10mmol,5mmol生物素-11-dUTP在25μl×NT缓冲液中（1×NT缓冲液含50mmol/l Tris –HCl,pH7.2,10mmol/L MgSO₄,100μM二硫苏糖醇（dithio threitol）,50μg/ml牛血清白蛋白），在预孵育时加入1μl的Klenow多聚酶。应用100ml 50mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl在65℃洗1min 以终止反应，然后放入100ml×BN缓冲液（100mmol/l NaHCO₃,Ph8.0,0.01%Nanidet P-40）40℃，进行检测系统的显示如荧光-亲合素标记，过氧化物酶-亲合素标记等。

总之，自Gall 和Pardue 1969年建立杂交免疫细胞化学以来的20余年中，已有不少新的改良的方法出现，但基本原则仍为Gall和Pardue所建立的相仿。作者个人体会是任何方法需在本人的实验实践中加以体验和改良。比如目前对乙酰基化作用，即浸入醋酸酐和三乙醇胺是否能减低背景染色的问题有作者对此提出异议。在科技工作者认为在原位杂交实验的所有应用溶液中加入0.1%～0.2%的二乙基焦碳酸乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）能有效的减低背景染色，但有些作者对此持怀疑态度。蛋白酶K的消化作用曾被认为是增加细胞或组织渗透性的关键步骤，但有作用在自身的实验室实践中体会除结构较致密的组织如脑、脊髓等外，对培养或涂片的单层细胞、蛋白酶K的消化及预杂交均是可以省略的。本文列举各作者的操作步骤略有不同，可能是基于这个原因。

目前，原位杂交技术主要应用于基因组图（Gene mapping），基因表达定位（localization of gene expression），核DNA和RNA的排列，mRNA的排列和运输（arrangement and transport of mRNA），复制（replication）和细胞的分类（sorting of cells）。临床研究应用在细胞遗传学（Cytogenetics），生前诊断（Prenatal diagnosis），肿瘤和传染性疾病的诊断，生物学剂量测定（biological dosimetry）和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探针的制备，标记方法和基本操作方法的不断改进，新的技术不断涌现，相信在不久的将来，原位杂交化学技术将会更广泛的被应用于各个学科，并不断为生命科学提供新的资料，开拓新的领域。