冻干皮上划痕人用布氏菌病活菌苗制造及检定规程

本品系采用布氏菌弱毒菌株，经培育后冻干制成。用于预防布氏菌病。

1　菌种

1.1　用弱毒牛型104M菌种。菌种应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。

1.2　菌种应经冻干，保存于2～8℃，并指定专人负责保管。

1.3　禁止使用通过动物后再分离培育出之菌株制造菌苗。

1.4　菌种的免疫力试验每3年至少检定一次。

1.5　菌种检定

1.5.1　培养特性

在含有1∶50000碱性复红培养基上应生长，但在含有同样浓度的硫堇培养基上不应生长（亦可用纸片法检查），在肝琼脂斜面培养基上产生微量硫化氢。涂片镜检应为革兰氏阴性球杆菌。

1.5.2　变异检查

用生理盐水将新鲜培养物制成含菌数为25亿～30亿/ml的菌悬液，置90℃水浴中30分钟，不应出现凝集现象。用同样浓度的菌悬液，与1∶1000三胜黄素水溶液等量混合，于37℃放24小时，不应出现凝集现象。用结晶紫菌落染色法检查，菌落变异率不得超过3%。

1.5.3　噬菌体裂解试验

将菌种接种于肝琼脂平皿上，滴加布氏菌Tb噬菌体1滴，于37℃培育44～48小时，在噬菌体流过的地方应无本菌生长。

1.5.4　血清学试验

用生理盐水将新鲜培养物制成含菌数为50亿/ml的菌悬液，与已知效价的布氏菌诊断血清作凝集反应，其凝集价应达到血清原效价。

1.5.5　残余毒力检查

用生理盐水将37℃培育44～48小时之肝琼脂斜面新鲜培养物制成菌悬液，并稀释成15亿/ml、30亿/ml、60亿/ml、120亿/ml和240亿/ml等5个浓度的菌悬液。取体重18～20g小白鼠25只分为5组，各组分别用不同浓度的菌悬液腹腔注射，每只0.5ml，观察7天，计算LD50，其值应为10～20亿菌。

1.5.6　免疫力试验

用生理盐水将菌种1代新鲜培养物制成浓度为2亿/ml的菌悬液。取体重300～350g豚鼠10只。每只皮下注射1ml，经25～30天后，每只豚鼠皮下攻击羊型强毒布氏菌10个或20个感染量（MID）。同时取3组健康豚鼠作对照，每组3只，分别于各组豚鼠皮下注射0.5、1及2个MID。免疫及对照豚鼠于注射毒菌悬液后均观察25～30天后解剖，取出鼠蹊部淋巴结、腹主动脉旁淋巴结、肝及脾分别接种肝琼脂中管斜面培养基，于37℃培育10天。如免疫动物组织之培养物有布氏菌生长，应用硫堇染科培养基（亦可用纸片法）和硫化氢反应做菌型鉴别试验。注射1个MID的3只对照豚鼠都必须发生全身感染，即肝脏或脾脏应分离出羊型毒菌。免疫组攻击10个MID时，　10只豚鼠中不应有2只以上分离出羊型毒菌；攻击20个MID时，10只豚鼠中不应有3只以上分离出羊型毒菌。

2　菌苗制造

2.1　制造菌苗的工作室应专用，不得与其他细菌工作混用。生产中应严格执行无菌操作，非制造菌苗用的其他布氏菌不得带到生产工作室内。

2.2　制造菌苗可用pH6.6～7.2的肝浸液琼脂或其他适宜培养基。

2.3　启开冻干菌种，接种在肝琼脂斜面或其他适宜的培养基上，放37℃培育44～48小时为第1代。第1代菌须进行1∶500三胜黄素玻片凝集试验，只有光滑型菌方可用于制造菌苗。第1代菌种斜面于2～8℃可保存15日。

2.4　将第1代菌种接种到肝琼脂或其他适宜培养基上，放37℃培育44～48小时为第2代菌种。经肉眼纯菌检查合格后，弃去凝固水，用无菌生理盐水制成菌悬液。

2.5　将第2代菌种接种到琼脂或其他适宜培养基上，放37℃培育44～48小时，肉眼逐瓶检查，有杂菌者废弃。

2.6　用含有蔗糖、明胶、硫脲和味精组成的保护液或其他适宜的保护液洗下菌苔或刮取菌苔，放入保护液内。每数瓶培养物可采入或刮入1瓶（或1大管）保护液内，此为菌苗原液，置2～8℃保存。每瓶（或大管）原液均按《生物制品无菌试验规程》进行纯菌试验。

2.7　将纯菌试验合格的原液合并，如每安瓿冻干菌苗为10人份，装量0.5ml原液，则应合并后的原液稀释成每ml含菌1800亿～2000亿，使每1人份菌苗含90亿～100亿。由原液采集到冷冻干燥之间隔不得超过7天。稀释后的原液经纯菌试验合格后即可分装安瓿冻干。

2.8　同一日采集的原液同一次冻干者为1批。如1批有数瓶，应分为亚批。

3　冷冻干燥

菌苗原液分装安瓿完毕后应立即在-30℃以下进行冷冻。干燥时间可根据水分含量及活菌数来决定。干燥完毕后进行真空封口。亦可用充氮封口。

4　成品检定

4.1　物理化学检查

冻干菌苗应为乳白色疏松体，加入生理盐水后，应于1分钟内溶解成均匀悬液。用真空测定器检查安瓿应为真空。水分含量不得超过3%。

4.2　菌型检查

每亚批菌苗应用硫堇培养基或纸片法及硫化氢反应做菌型鉴别检查，应呈牛型布氏菌的培养特性。

4.3　纯菌试验

每亚批菌苗抽样按《生物制品无菌试验规程》进行。

4.4　活菌计数及菌落变异检查

每亚批取3支安瓿，加生理盐水溶解混匀后比浊。将菌液浓度稀释为含菌10亿/ml，再用生理盐水做10倍系列稀释至10^-6，取10^-6或其他适宜的稀释度之菌液接种5个平皿，每个平皿接种0.1ml。用涂菌棒涂匀后放37℃培育4～5天，计算活菌数。冻干后活菌率不得少于50%，如不合格可复试，经复试仍低于50%者则该批菌苗废弃。同时用结晶此菌落染色法检查，菌落变异率不得超过10%。

4.5　浓度测定

菌苗经溶解后，按中国细菌浊度标准测定浓度，每人份含菌数应为90亿～100亿。

4.6　安全试验

每亚批取3支安瓿，用生理盐水溶解后混匀。用体重18～20g小白鼠5只，每只皮下注射10亿菌/ml的菌悬液0.5ml。观察7日不应有死亡，如有死亡应复试一次，仍有死亡，则该批菌苗废弃。

4.7　免疫力试验

10批以下者至少抽1批进行免疫力试验，10批以上者，每10批抽1批。用灭菌生理盐水溶解冻干菌苗，并稀释成5亿菌/ml菌悬液。取体重300～350g豚鼠10只，每只皮下注射1ml。经25～30日后，每只豚鼠皮下攻击羊型线毒布氏菌10个或20个MID。同时用3组健康豚鼠作对照，每组3只，各组豚鼠分别于皮下注射0.5、1和2MID。各组不能自拔于注射毒菌悬液后25～30日解剖，取鼠蹊部淋巴结、腹主动脉旁淋巴结、肝及脾，分别接种肝琼脂中管斜面培养基，于37℃培育10天。如免疫动物组织之培养物有布氏菌生长，需用硫堇培养基（亦可用纸片法）和硫化氢反应做菌型鉴别试验。注射1个MID的3只对照豚鼠都必须发生全身感染，即肝脏或脾脏应分离出羊型毒菌。攻击10个MID时，10只免疫豚鼠中不应有3只以上分离出羊型毒菌；攻击20个MID时10只免疫豚鼠中不应有4只以上分离出羊型毒菌。

5　保存与效期

应保存于2～8℃暗处。自冻干后活菌数检定合格之日起效期为1年。