《中国生物制品规程》 > 流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程
流行性乙型脑炎（下称乙脑）灭活疫苗是将乙脑病毒接种于地鼠肾细胞，培育后收获病毒液，加入甲醛溶液将病毒杀死后制成。用于预防乙脑。
1 毒种
1.1 毒种来源
P3株病毒，每3～5年应用新分离的乙脑流行株病毒检查P3株的保护力，以了解该毒株的有效性。P3株干燥毒种由中国药品生物制品检定所分发。
1.2 毒种检定
1.2.1 无菌试验
毒种启封和每次传代后均需做无菌试验，合格者方可使用。
1.2.2 病毒滴定
每正代必须用体重7～9g小白鼠进行脑内滴定，滴度≥9.0LogLD50/1.0ml可用于生产。
1.2.3 纯毒试验
生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在500以上。生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。
1.3毒种传代
分正亚代传递。从检定所取回的干燥毒种传递不超过15代称正代，由正代传递一代直接用于生产称亚代。每次用于传代的毒种不得少于3个鼠脑。
传代时选用体重7～9g健康小白鼠或乳鼠，脑内接种病毒，72小时后选眼结膜正常，有典型痉挛战粟、肢体麻痹的小白鼠，无菌取脑并进行无菌试验。
1.4 毒种保存
鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于-60℃以下，无菌试验通过后方可使用。亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成10%脑悬液，分装小瓶冻存于-60℃以下，无菌试验合格后备用。
2 疫苗制造
2.1 细胞制备
2.1.1 地鼠
选用健康地鼠。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。
2.1.2 细胞消化及培养
取肾剪碎，用适量的胰蛋白酶溶液消化。用营养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，于37℃进行培养。营养液中牛血清含量不得超过8%。
2.1.3 外源因子检查
每生产批细胞留5%（或不少于500ml）悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行，至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。并用0.2%～0.5%豚鼠红细胞（4℃保存不超过7天）进行血吸附试验，置4～8℃30分钟判定结果，再置20～25℃30分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。
2.2 病毒接种和培育
挑选生长良好的细胞瓶，充分淋洗细胞后加入适量维持液，接种病毒，病毒量不得＞7.0LogLD50/1.0ml。在适当温度下培育适当时间，弃去病毒培养液，换以新维持液，继续培育一定时间。
疫苗生产过程中不得加青霉素或其他β内酰胺类抗生素。
2.3 原液
2.3.1 过滤
选择有典型细胞病变的培养瓶，经肉眼检查无菌者进行澄清过滤，细胞质量好时，可再加入新维持液，继续培育，再次收获病毒液。
2.3.2 病毒灭活
过滤后的原液，于取出无菌试验和病毒滴定样品后加入甲醛溶液，其最终浓度不得超过0.05%，置适当温度下一定时间灭活病毒。过滤后加入硫柳汞防腐剂，其最终浓度不得超过0.01%。
2.3.3 原液检定
2.3.3.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.3.3.2 病毒滴定
每个滴定批代表疫苗不得超过15万ml，将样品10倍系列稀释，取至少3个稀释度，每个稀释度用体重7～9g小白鼠4只，每只脑内接种0.03ml，逐日观察，3日内死亡者不计，观察14天，滴度≥7.0LogLD50/1.0ml判为合格，不合格者可重试一次。
2.4 半成品
2.4.1 半成品取样
无菌试验合格及病毒灭活到期的疫苗原液，取样做灭活试验、效力试验和无菌试验。每次解剖的地鼠制备的疫苗为一生产批，按生产批进行检定，但每批灭活试验代表疫苗量不得超过15万ml，每批效力试验代表疫苗量不得超过100万ml。无菌试验按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.4.2 半成品检定
2.4.2.1 灭活试验
（1）动物法：将样品脑内接种体重12～14g小白鼠8只，每只 0.03ml，同时腹腔接种0.5ml，为第一代；7天后将第一代小白鼠处死3只，取脑做成10%悬液，脑内接种6只小白鼠，为第二代；7天后将第二代小白鼠处死3只，同法接种6只小白鼠，为第三代。从接种之日起逐日观察14天，每代小白鼠除处死和接种后3日内非特异性死亡者外，全部健存为合格。
若传代3日后有个别小白鼠死亡，应立即取死鼠脑乳化成悬液再接种3只小白鼠，观察14天，该3只小白鼠健存仍判为合格。如仍有小白鼠死亡，该批疫苗应重试，重试合格后仍可使用。若传出活病毒应重试，查明原因。必要时继续灭活并进行灭活试验，若仍传出活病毒，该批半成品应予废弃。
（2）细胞培养-动物法：将样品25ml透析24小时后，接种地鼠肾细胞或BHK21细胞，每ml样品接种不少于3cm2细胞片，置培养病毒的温度下培育14天，不得有细胞病变出现。到期的培养液脑内接种体重7～9g小白鼠10只，每只0.03ml，观察14天，应全部健存。若有死亡者应查明原因或重试，重试合格者仍可使用。不合格者应废弃。
以上两种灭活试验方法可任选一种。
2.4.2.2 效力试验
采用免疫小白鼠中和抗体测定法。中和抗体测定采用蚀斑减少试验。参考疫苗（RA和RB）及中和试验阳性血清由中国药品生物制品检定所提供。
将被检苗（T）和参考苗（R）稀释成1∶32腹腔免疫体重12～14g小白鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天，第二次免疫后7天采血，分离血清，同组小白鼠血清等量混合，56℃30分钟灭活，备用。
稀释阳性血清、被检苗血清和参考苗血清，分别与稀释好的病毒（约200PFU/0.4ml）等量混合，同时将稀释好的病毒再1∶2稀释，作为病毒对照，置37℃水浴作用90分钟，接种6孔板BHK21细胞，每孔0.4ml，37℃孵育90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于CO2孵箱中培育5天，染色，蚀斑计数，计算被检苗和参考苗组对病毒对照组的蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50～150之间。
判定标准
（1）合格：T≥（RA+RB）/2-0.33
（2）重试：（RA+RB）/2-0.66＜T＜（RA+RB）/2-0.33
（3）不合格：T＜（RA+RB）/2-0.66
2.4.2.3 残余牛血清蛋白含量测定
用检定所认可的试剂和方法测定，残余牛血清蛋白含量应≤50ng/ml。
3 成品检定
3.1 外观检查
疫苗应为橘红色透明液体，无异物，无沉淀。
3.2 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
3.3 化学检查
按《生物制品化学检定规程》进行。pH值为7.2～8.0。游离甲醛不高于0.05%，硫柳汞不高于0.01%。
3.4 安全试验
每批疫苗腹腔注射体重18～20g小白鼠4只，每只0.5ml，逐日观察3天，均应健存，如有小白鼠死亡，除检查原因外，应立即进行重试。
3.5 亚硫酸氢钠检定
分装后的亚硫酸氢钠要进行含量测定和无毒性试验。含量不得低于原配浓度的60%。无毒性试验系将样品稀释成1∶100，腹腔注射体重18～20g小白鼠2只，每只0.5ml，观察5日，应全部健存。
4 保存与效期
保存于2～8℃暗处。自效力检定合格之日起效期为2年。