冻干基因工程α1b干扰素制造及检定规程

本品系用从健康人白细胞中获得的α1b干扰素基因重组质粒，转染大肠杆菌，使之高效表达人α1b干扰素，经高度纯化后冻干制成。用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛细胞白血病等疾病。

1　菌种

1.1菌种来源

系带有人α1b干扰素基因的pBVXα1b质粒转化的大肠杆菌JM103株。投产的工程菌需经卫生部批准。

1.2菌种特性

菌种表达稳定，表达水平符合投产菌种要求。

1.3制造用菌种库的建立

从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造用菌种库传出，扩大后冻干保存作为制造用菌种库，但每次只限传三代。每批制造用菌种库均应进行下列检定，合格后方可投产。

1.3.1划种LB琼脂平板

应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。

1.3.2涂片革兰氏染色

在光学显微镜下观察应为典型的革兰氏阴性杆菌。

1.3.3对抗生素的抗性

应与原始菌种相符。

1.3.4电镜检查

应为典型大肠杆菌形态，排除支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

1.3.5生化反应

应符合大肠杆菌生物学性状。

1.3.6干扰素表达量

在摇床中培养，应符合原始菌种的表达量。

1.3.7表达的干扰素型别

应用标准抗α型干扰素血清作中和试验，证明型别无误。

1.3.8质粒检查

应做该质粒的酶切图谱，应与原始质粒相符。

1.4种子液制备

1.4.1菌种传代用LB培养基

液体LB培养基不含琼脂，供摇床培养用，含2%琼脂供制备平板和斜面用，含0.5%琼脂的半固体供短期保存菌种用。

1.4.2生产菌种的制备和检定

取制造用菌种库冻干菌种，开启后划种培养基平板2～3块，培养后挑取平板中典型集落8～10个，分别培养后保存，然后分别进行干扰素表达量测定，至少重复一次，先其中干扰素表达量最高的一份供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种库的表达量，所表达的干扰素应用标准抗α型干扰素血清作中和试验，证明型别无误。

1.4.3种子液的制备

将菌种接种M9CA培养基，在摇床中培养至OD值在0.4～0.8之间即可供发酵罐接种用。种子液应进行质粒稳定性检查。

2　发酵

2.1每次发酵前必须进行一次空罐灭菌。

2.2发酵用GMD培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素，配制后进行实罐灭菌。

2.3发酵温度为36.5±0.1℃，根据工程菌生长情况到后期可适当调整温度，并作必要的培养基成分添加，发酵时间根据工程菌生长情况确定。发酵结束时放出菌液，发酵灌应再进行一次灭菌并清洗。

3　收菌

用离心法收取菌体，称重，容器上标明批号、罐别、重量、日期。收获的菌体如在24小时内破菌裂解可保存于4～8℃冷库，否则应置?/FONT>30℃冻存。

4　菌体裂解与粗制干扰素制备

用高压匀浆法裂解菌体，将菌体作成10%～20%的悬液进行高压匀浆，压力50Mpa/cm²，连续匀浆二次，匀浆后的悬液离心后取上清即为粗制干扰素。

5　浓缩与纯化

5.1初步纯化

采用不同原理多步骤的方法，使初步纯化的干扰素达到外观无色透明，无絮状物，比活性在105IU/mg蛋白以上，并将其浓缩至原体积的1/10～1/20，保存于4℃，如3天内不能进行高度纯化，应冻存于?/FONT>30℃冰箱内。

5.2高度纯化

经初步纯化后进行高度纯化，去除绝大部分非干扰素蛋白，使其达到本规程7～8项要求。高度纯化应在洁净度为10000级的恒温（15～18℃）室内进行。

5.3在高度纯化过程中应进一步浓缩，使体积为初步纯化干扰素的1/5～1/10。并应转换缓冲液系统，使之适合于人体注射用。

5.4在整个浓缩与纯化过程中不得加入对人体有害的物质。

5.5在浓缩纯化过程中应特别注意去除热原质，用于分子筛层析的溶液，配合后应进行去除热原质处理。容器应干热灭菌，不能干热灭菌者应用适当浓度的NaOH处理。

5.6浓缩纯化最后所得的纯化干扰素即为“半成品原液”，取样进行7.1～7.4项检定后，立即加入人白蛋白，使其最终含量为2%，称为“加白蛋白半成品”，取样测定干扰素效价，其余冻存于－30℃冰箱中，应尽量避免冻融。

5.7所用的人白蛋白应符合相应规程要求，HBsAg。

6　稀释、除菌过滤

6.1将检定合格的加白蛋白半成品以乳径为0.22μm的滤膜除菌过滤，除菌后立即进行稀释。

6.2稀释液制备

用合格的蒸馏配制生理盐水，经高压灭菌，加入检定合格的注射用人白蛋白，使最终含量为2%，即为稀释液。配制后应立即用于稀释。

6.3稀释

除菌后加白蛋白半成品用稀释液稀释至所需浓度。稀释后用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌，保存于4℃，并取样作无菌试验和热原试验，合格后进行冻干。

7　半成品检定

每批半成品抽样进行7.1～7.7项检定。启开新菌种生产的前3批或生产条件有较大改变时进行7.8～7.12项检定。

7.1效价测定

用细胞病变抑制法，Wish细胞/VSV为检测系统。用国家参考品校准为IU。

7.2蛋白含量

用Lowry法测定。同批不同阶段的样品比较时应尽可能同时测定。

7.3比活性

根据效价测定及蛋白含量计算比活性，本品的比活性应在107IU/mg蛋白以上。

7.4纯度

7.4.1电泳纯度

用非还原型SDS?/FONT>PAGE法，加样量不低于5μg，经扫描仪扫描，纯度应在95%以上，聚合体不得超过10%。

7.4.2高效液相色谱纯度

用280nm检测，应呈一个吸收峰，或主峰占总面积95%以上。

7.5分子量测定

用还原型SDS?/FONT>PAGE法。加样量不低于5μg。制品的分子量与理论值比较，误差不超过10%。

7.6残余外源性DNA含量

用固相斑点杂效法，以地高辛标记的核酸探针法测定，其含量应少于100pg/剂量。

7.7残余IgG含量

如采用单克隆抗体亲和层析法纯化，应进行本项检定。采用ELISA双抗体夹心法测定，IgG含量应少于100ng/剂量。

7.8残余工程菌蛋白含量

用酶标法或其他敏感方法测定，残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的0.02%.

7.9抗生素活性

半成品中不应有残余氨苄青霉素活性。

7.10肽图测定

应符合α1干扰素的图形，批与批之间图形应一致。

7.11等电聚集

测定等电点，应有固定的范围（4.0～6.5之间）。

7.12紫外光谱扫描

检查半成品的光谱吸收值，批与批之间应一致，应有固定的最大吸收值。

8　除菌半成品检定

8.1效价测定

同7.1项。

8.2无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

8.3热原质试验

按《生物制品热原质试验规程》进行。每只家兔静脉注射干扰素5万，判定标准按该规程4.1项要求进行。

9　成品检定

9.1处观

应为微黄色薄壳状疏松体，加入1ml蒸馏水后溶解迅速，不得含有肉眼可见的不溶物。

9.2　pH值

pH值应为6.5～7.5。

9.3无菌试验

同8.2项。每批抽样不少于10支。

9.4水分

应≤3%。

9.5热原质试验

同8.3项。

9.6价测定

同7.1项。效价应为标示量的80%～150%。

9.7安全试验

9.7.1豚鼠试验

用体重300～400g豚鼠2只，每只腹侧皮下注射1ml（于1ml生理盐水内），观察7天，豚鼠应健存，每只体重增加判为合格。

9.7.2小白鼠试验

用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射0.5ml（于0.5ml生理盐水内），观察7天，动物应健存，每只体重增加判为合格。

10规格

10μg/瓶，20μg/瓶和30μg/瓶。

11保存与效期

保存于2～8℃，自效价检定合格之日起效期为2年6个月。