布氏菌素制造及检定规程

本品系牛、羊、猪型布氏菌的30天肉汤培养物，经加温杀菌的除菌过滤液。对已有布氏菌感染或曾接受布氏菌活菌苗免疫之机体。能引起特异的皮肤变态反应。供布氏菌病的诊断及检测免疫反应用。

1　菌种

1.1　制造布氏菌素所用牛、羊、猎型布氏菌菌种应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。

1.2　菌种用冻干法保存。同1批冻干菌种经检定合格后，保存于2～8℃，每次启开菌种时可只做菌型鉴别及变异检查。凡在培养基上传代保存者，每月必须做变异检查。

1.3　菌种检定

1.3.1　培养特性

各型布氏菌菌种之硫堇、碱性复红染料抑制试验及硫化氢反应应具有型有典型特性。

1.3.2　变异检查

用三胜黄素凝集及加热沉淀反应作变异检查。如有变异则不可用于制造布氏菌素。

1.3.3　血清学检查

用各型菌种的新鲜培养物分别与已知效价的布氏菌诊断血清作凝集反应，其凝集价应达到血清之原效价。

2　制造

2.1　制造布氏菌素至少要用牛、羊、猎型菌种各1株，分别在pH6.8～7.0的普通肉汤中培育。

2.2　各型菌种分别接种在肝琼脂或其他适宜培养基上，于37℃培育44～48小时，经检查不含杂菌者，用灭菌生理盐水将菌苔洗下制成菌液，接种各大瓶肉汤培养基中，每1000ml培养基约接种200亿～500亿菌体，放37℃培育30天，在培养期的最初5天，要每天用肉眼逐瓶检查，凡有杂菌生长者应废弃。

2.3　纯菌试验

培养到期后，各瓶肉汤培养物分别抽样按《生物制品无菌试验规程》做纯菌试验，凡有杂菌生长者应废弃。

2.4　加温杀菌

将纯菌试验合格的每瓶肉汤培养物置水浴中，80℃加温1小时杀菌。

2.5　无菌试验

加温杀菌之各瓶培养物冷却后逐渐抽样按《生物制品无菌试验规程》做无菌试验，不应有布氏菌及杂菌生长。

2.6　除菌过滤

取检查合格的牛、羊及猪型肉汤培养物等量混合，然后除菌过滤作为1批。同批肉汤培养物同时滤入数瓶时按瓶分为亚批。

2.7　分装

除菌过滤后，必须将滤液尽快分装安瓿。封口后，将所有安瓿置37℃培育5日。长菌温浊及外观不合格者废弃。布氏菌素不加任何防腐剂。

2.8　制备对照液

用同批培养基但不接种布氏菌，于同样条件下培养制成布氏菌素对照液，并分装安瓿供检定用。

3　成品检定

3.1　物理检查

布氏菌素为澄明的淡黄色液体，无沉淀，无异物。

3.2　无菌试验

每亚批菌素均应按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。

3.3　毒性及安全试验

用弱毒菌生产时，每亚批菌素抽样只做毒性试验。用体重18～20g小白鼠5只，每只皮下注射布氏菌素0.5ml。注射后3日内全部小白鼠健存，毒性试验判为合格。凡有死亡者应复试1次，如仍有死亡则该批菌素应废弃。如用毒菌生产，则半成品及成品均须做毒性及安全试验。将毒性试验全部活存之小白鼠，在注射后20日解剖，取鼠蹊部淋巴结，腹大动脉旁之淋巴结及肝、脾分别接种肝琼脂斜面上，放37℃培育5天。如无布氏菌生长，安全试验即判为合格。

3.4　效力试验

用牛型104M菌株或其他弱毒布氏菌株约10亿活菌，皮下注射体重250～300g豚鼠。豚鼠在免疫后2～6个月内均可供作效价试验用，但每只豚鼠只可作1次试验。每批菌素用4只已免疫的豚鼠和2只健康豚鼠，背部脱毛后，分别在3处皮内注射布氏菌素原液、10倍稀释液及对照液各0.1ml。注射部门之间距至少3cm。注射后24及48小时观察反应，免疫豚鼠在注射布氏菌素原液处应有明显红肿反应，10倍稀释液处可有微弱红肿反应，对照常液处应无反应。健康豚鼠各处均应无反应。

4　保存与效期

应保存于2～8℃。自检定合格之日起效期为2年。