人二倍体细胞建株、检定及制备疫苗规程

人二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。

[B]A细胞株的要求[/B]

用于疫苗生产的人二倍体细胞株（以下简称细胞株）须按下列规定进行全面检定。新建立细胞株，应按《新生物制品审批办法》进行审批。

1　建立细胞株必须具备下列资料

1.1　建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，中止妊娠原因。

1.2　建立细胞株所用胎儿的父、母年龄、职业及健康状况，胎儿父、母系三代应无明显遗传缺陷和肿瘤疾病历史。在取胎儿组织时，应作出详细调查，报卫生部审批前，应进行一次重复调查。

1.3　原始组织种类，原代培养的数量与生长状况。

1.4　细胞培养史和生长特征，细胞寿命、世代数。

1.5　细胞生长液的成分。

2　细胞株的检定

2.1　染色体的鉴定和制片

细胞原系建株过程，每8～12世代*应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有4～5次染色体检查结果。

每次染色体检查，应从同一世代不同细胞培养瓶中取细胞混合再培养，制备染色体标本片。染色体标本应长期保存（直至褪色不能用为止），以备复查。

每次染色体检查，至少应随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并作出有助于复查的记录，其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析。并应粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。

可以G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。以显带技术检出的核型异常（假二倍体、倒位、易位等）发生率应用比现用上限更宽的基本数据进行评价，合格上限尚未定出。

2.1.1　合格要求

1000个和500个中医细胞标本中，检查异常率、合格的上限（可信限95%，Poison法）如表1。

表1

*亚二倍性超过上限时，可选用批标本片重数

**+一个中期细胞内超过53条染色体即为一个多倍体

2.1.2　染色体制片要求

应及时进行制片质量检查，如发现细胞堆积，染色体分散不好等，由于技术原因不适于读片时，可以及时重新制片。但已经读片后，不断因某项超过标准（亚二位性除外）而废弃不算。如考虑到制片技术与质量问题，可重试两次，当有一次结果与原结果相近时，又无可知原因，应以原结果为准。

2.2　外源因子检查

细胞株不应有细菌、霉菌、支原体和病毒等污染。每8～12世代细胞培养物，应进行下列检查。

2.2.1　细菌、霉菌、支原体检查

按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.2.2　病毒检查

2.2.2.1　细胞直接观察及红细胞吸附试验

取混合瓶细胞样品，接种小瓶或小管，长成单层后更换维持液，观察2周，镜检细胞，应保持正常形态特征。培养7天，用0.2%～0.5%鸡和豚鼠混合红细胞悬液进行红细胞吸附试验，先置于4～8℃，后置于20～25℃，各30分钟，两次观察结果均应为阴性。

2.2.2.2　细胞培养检查

细胞培养的上清液混合样品，至少接种4种细胞（原代人肾或猴肾细胞、原代兔肾细胞、人源传代细胞和另一批人二倍体细胞）。接种的样品量应占维持液的20%以上，于培养5～7天和14天时，进行红细胞吸附试验（见2.2.2.1项）。培养7天的上清液在同种细胞培养上盲传一代，观察14天，应无细胞病变，红细胞吸附试验应为阴性（在该试验的细胞维持液中，允许加入少量该细胞培养用的牛血清，以利细胞维持和观察）。

2.2.2.3　动物试验检查

用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和鸡胚各一组。每组动物或鸡胚接种受检细胞不应少于10⁷。按表2所列要求进行试验和观察。如80%以上动物和鸡胚健存，此试验为通过。

2.2.2.4　其他检查

细胞株传代过程中，至少于2个不同世代水平进行包涵体、乙型肝炎表面抗原及电镜检查，结果均应为阴性。

2.3　肿瘤原体检查

每8～12世代做一次细胞株的异种移植试验，观察细胞株有无致肿瘤性质，每次实验使用6只乳鼠（3～5日龄）或体重8～10g小白鼠，经抗胸腺血清（ATS）处理，皮下接种活二倍体细胞（最适传代的细胞），观察14天，检查有无结节形成。有结节或可疑病灶时，做病理切片检查。试验同时，用HeLa或其他人源传代细胞系做阳性对照试验，用动物数与处理方法同试验组，接种被检二倍体细胞数应为对照肿瘤细胞数的5倍以上。结果二倍体细胞株不应有移植瘤形成，而对照组细胞则应有80%或更多的动物有典型移植瘤出现（肿瘤结节需经病理组织学诊断）。

表2

*豚鼠于注射前及观察4周作旧结核菌素试验，应为阴性

**每只于背部皮内注射10处，每处0.1ml

***应用豚鼠和鸡混合红细胞作直接血凝试验

可以用任何以免疫抑制剂处理，并对肿瘤细胞有同样敏感性的其他动物试验，如无胸腺小白鼠（nude　nu/nu基因型等）。

3　细胞种子

细胞株传代过程的早期，应选定适应世代数培养出大量细胞，制成悬液，分装安瓿作为细胞种子。置液氮中冻存，以备细胞株建成后，大量供应细胞。

冻存的种子细胞活存率应在60%以上。冻存后一定时间，应至少复苏培养一系至衰老期，并在不同传代水平，检查细胞株的生长、胞核学特征、异种移植等，证明细胞经冻存后的生物学性质无明显改变。

[B]B二倍体细胞用于疫苗生产的要求[/B]

1　细胞

1.1　细胞株

用于疫苗生产的细胞株，必须符合本规程要求。不含外源因子、核型正常、对病毒敏感和具有足够多的细胞种子。可用KMB-17、2BS等细胞株。所用细胞株均须经卫生部批准。

1.2　细胞种子批

一个细胞种子批应有足够量早世代细胞，分装安瓿保存于液氮中，作为细胞种子。

2　生产用细胞种子批

用一个或数个细胞种子安瓿传代增殖到适宜世代，具有一定量的均一细胞悬液，分装安瓿，标明世代、安瓿号和冻存的日期，保存于液氮中，作为生产用细胞种子。

2.1　生产用细胞种子批检定

2.1.1　细菌、霉菌、支原体检查

按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.1.2　动物和鸡胚检查外源因子

用生产用细胞种子世代水平或至2/3世代寿命水平的细胞作检定样品。用下列动物和鸡胚检查：

各种动物和鸡胚的接种法、观察期，按照A2.2.2.3条进行。

2.1.3　肿瘤原性检查

按A2.3项执行。

2.1.4　染色体的监测

检查用于生产的最后一个世代或其后任一世代，至少检查500个中期细胞的多倍性、染色体精确计数、断裂率、结构异常及其他异常发生率，例如螺旋消失或初级次缢痕或次级次缢痕的明显减弱等。按A2.1.1项进行评价。

生产用细胞库细胞染色体监测用的染色体标本片和照片，应作为该细胞批监测此细胞生产疫苗批的记录，永久保存。

3　生产用细胞的培养

3.1　从生产用细胞种子开始传代培养，以适宜分种率连续传代，直至增殖足够量的细胞培养物用于生产。用于生产的细胞世代，应在细胞整个寿命期的前2/3世代内。

3.2　细胞外源因子检查

于种毒当天，或在连续传代种毒，于最后一次细胞种毒当天，此批细胞留取2%～5%不种毒，换维持液作为正常细胞对照，以检查外源因子。从换液之日起观察2周，细胞应无异常变化。

用换维持液0～2天的对照细胞上清液，接种原代兔肾、非人灵长类传代细胞及另一批人二倍体细胞，接种样品量应占维持液的20%。观察14天，换液后5～8天用上清液，在相应细胞盲代一代，观察14天，做血吸附试验。

在收毒时，用0.2%～0.5%鸡和豚鼠红细胞，在2～8℃和20～25℃做血吸附试验，应为阴性。

3.3　细胞鉴别试验

在生产用细胞世代水平或其后数代，检查300个中期细胞，计数多倍体，作100个中期细胞染色体检查，应核型正常，鉴别确为本细胞无误。

除染色体监测外，还可用HLA表面抗原鉴定试验。

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*细胞“世代”的说明：英文是“Population　doubling”，简写“PD”，译成“群体培增”，为通俗和习惯以名词“世代”来表示。PD可按实际计数，增加一倍，或按细胞培养面积，增加一倍，为一个PD，即一个世代。也就是细胞以1:2分种率传代则为一个世纪，以1:4分种率传代则为2个世代，1:8分种率传代则为3个世代。