达芬奇从30岁左右开始记录自己艺术创作的心得和科学研究成果，准备写成绘画论、力学和解剖学3部著作，可惜未能实现，只遗留下大批笔记。达芬奇的绘画论笔记按内容大致可分为美学理论和绘画的基本科学两部分：前者主要讨论绘画和现实的关系，绘画和其他艺术的关系；后者则阐述透视学、光影学、人体比例和解剖学，人们的动态和表情以及自然现象等知识。
达芬奇的有关美学思想的笔记是将绘画与诗、音乐、雕刻等艺术加以比较。从古代到文艺复兴时代以前，绘画的地位一向低微，被贬称为贵族所不屑为的“技艺”，是一种“手艺劳动”，是“机械艺术”，等等。到了文艺复兴时代初期，这种传统的见解仍然根深蒂固。在那个生产关系大变动的时代，造型艺术家和手工业者一样属于社会先进的阶层，他们中许多人既是高明的艺术家，又精通冶炼铸造、人体解剖以及几何、数学，他们的活动开了日后实验科学的先河。因此，画家们自然不能忍受卑微的地位，起来反抗旧的传统观念，达芬奇为绘画的辩护就反映了当时画家的呼声。达芬奇将绘画和音乐、诗歌、几何、天文等所谓“自由艺术”逐一比较，证明绘画绝不是什么“机械的手工劳动”，而是一门科学，是自然的“合法的儿子”，是研究自然和表述科学知识最有效的手段，这是“比较论”中重要的主题思想之一。
达芬奇根据“我们的一切知识来源于知觉”这一观点，分析绘画与现实的关系，指出自然是绘画的源泉，绘画是自然的模仿者。达芬奇又根据古罗马以来绘画的发展史，指出：如果画家取法自然，绘画就昌盛；不取法自然，绘画就衰微。从哲学和历史两方面说明画家必须以自然为师。达芬奇还进一步阐述：“画家的心应像镜子一样，将自身转化为对象的颜色，并如实摄进摆在面前的一切物体的形象，应当晓得，假如你们不是一个能够用艺术再现自然一切形态的多才多艺的能手，也就不是一位高明的画家。”这就是说绘画是反映在画家心里的自然，借艺术手段将它再现出来。达芬奇又指出：“作画时单凭实践和肉眼的判断而不运用理性的画家就像一面镜子，只会抄袭摆在面前的东西，然而对它们一无所知。”（以上均引自《达芬奇论绘画》）达芬奇要求画家不仅依靠感官去认识世界，而且要运用理性来揭示自然界的规律。达芬奇一方面以自然为师，一方面又十分强调理性的重要，要求画家具备透视学、光影学、人体解剖学等方面的知识，以之指导创作，忠实地反映自然万物的形态，并和丰富的想像力结合，创造出自然中没有的形象。
油画：岩间圣母，画家：达芬奇
我们可以从达芬奇的作品中看到上述观点的具体运用。例如，《岩间圣母》不但准确而生动地描绘了岩石溶洞与地形，同时也巧妙地运用光线，使圣母等形象成为视觉中心。作为背景的明亮的天空既营造出空间深度，又成功地烘托出主体人物形象。圣母的形象更是母爱的化身。在《最后的晚餐》中，达芬奇通过对每个人物的衣饰、表情、动作的生动描绘，使每个人物的个性特征得以充分展示．同时他又将人物的性格典型化，如耶稣和犹大的形象就是善与恶的化身。
壁画：最后的晚餐，画家：达芬奇
另外，达芬奇还热情地歌颂眼睛和视觉。因为眼睛是人的心灵和外界沟通的要道，是最准确的感官，所以达芬奇认为以视觉为基础的绘画最适于描绘物体的形态美和揭示自然现象的规律。又因为人类大部分知识来自视觉，所以以视觉为基础的绘画就成为人类认识自然和传达真善美的最有力的手段，从而成为一门科学，绘画的任务是艺术地再现自然。
达芬奇认为：画家是自然与人类之间的中介者，是自然创造物的再现者，他的精神必须包罗万象，只有向自然学习，才能做到这点。他凭借敏锐的视觉，观察自然和人生，他像镜子一样真实地映摄自然形象，广泛地收集素材，然后去粗取精，在脑中形成一个丰富的形象宝藏，再去进行艺术创造。而这一切的基础就是画家对透视、光影、解剖、动植物学等知识的掌握。
达芬奇将研究空间关系的透视学分为三支：线透视、色彩透视和隐没透视。在总结了前人关于线透视学上的成就后，达芬奇结合许多生动实例来研究空气和雾霭对远景的色彩和形状的影响，提出了空气透视（即色彩透视）和隐没透视的学说。达芬奇研究怎样利用空气透视来弥补线透视的不足，他认为绘画拥有空气透视是画面胜于雕塑的一个方面。画家掌握了空气透视后，他的画中就有了大气空间，由于远景与眼睛之间隔有朦胧的氛围，空间的深度感就加强了。另外，达芬奇还从物理光学和生理光学的角度来研究人对物体的视觉印象如何随距离的变化而变化，要求画家在作画时遵循隐没透视的原则。
为了表现三维空间，达芬奇还孜孜不倦地研究光影学。在明暗处理上，达芬奇偏爱丰富的层次，他认为物体形状只有依靠光和影才能呈现出来，利用明暗使平面呈现出浮雕的感觉，这是绘画最神奇的一面。
油画：蒙娜丽莎，画家：达芬奇
他达芬奇首创了明暗转移法，即画像上由明到暗的过渡是连续的，像烟雾一样没有截然的分界。达芬奇的《蒙娜丽莎》和《圣母子与圣安娜》就是运用明暗转移法的典范。传记作家瓦萨里说过，达芬奇的明暗转移法是绘画艺术的转折点。达芬奇还认为色彩从属于光影，物体的颜色与光照以及周围物体的颜色有关系。这个观点在某种程度上成为后来法国印象派色彩理论的肇始。
油画：圣母子与圣安娜，画家：达芬奇
作为文艺复兴中坚定的人文主义者的达芬奇与当时的艺术大师一样，以极大的热情研究人体结构，认为人体是自然界中最完美的东西。“人是小宇宙”这一思想支配了文艺复兴时期的艺术实践。解剖学是真实表现人的形态时必须具备的知识。达芬奇十分重视解剖学，从韦罗基奥的画坊开始直到晚年，研究了40多年，解剖了30多具尸体。达芬奇认为人体解剖是了解人体动态的钥匙，运动是一切生命的源泉，最能表现生命的意向。达芬奇指出：“人在不做作时的动作、手势和表情必定和这人的思想感情相适应。”因此，他把动态、手势、表情看成是绘画中揭示人物内心世界的手段，《最后的晚餐》就是一个极好的例子。达芬奇这一人体动态理论对后来的艺术理论和实践有着深刻的影响。
在《达芬奇论绘画》中，达芬奇还讨论了素描和速写的作用，认为它们是学习自然的重要手段。对衣饰和风景的描绘也提出了自己的见解。可以说，这是一本总结了达芬奇那个时代绘画艺术成就的百科全书。
达芬奇，这位文艺复兴时期伟大的艺术革新家，正是他将科学知识和艺术想象有机地结合起来，使当时绘画的表现水平发展到一个新阶段；是达芬奇将解剖、透视、明暗和构图等零碎的知识，整理成系统的理论，对后来欧洲绘画的发展影响很大。作为哲学家、自然科学家的达芬奇，他的哲学思想接近唯物主义，认为自然界的一切都服从于客观的必然性规律，认识起源于感觉；同时达芬奇又指出理论概括的重要性，人们必须“从经验出发，并通过经验去探索原因”。达芬奇强调数学和力学是自然科学的基础。在地质学、物理学、生物学和生理学等方面，都提出了不少在当时具有创造性的见解。在军事、水利、土木、机械工程等方面，都有许多重要的设想和发现。达芬奇为后人留下了大量的笔记、草图，涉及面非常之广。
达芬奇，这位历史上屈指可数的学识渊博的巨人，他的功绩和天才为后世所景仰，他创造的艺术高峰更使后来者望而兴叹。正如达芬奇的学生法朗切斯柯，米尔兹所说：“达芬奇的死对每一个人都是损失，造物主无力再塑造一个像他这样的人了。”