第四节　非酯化脂肪酸测定

临床上将C₁₀以上的脂肪酸称为游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）或非酯化脂肪酸（nonesterifiedfatty acid,NFFA），正常血清中含有油酸（18:1,W⁹）占54%，软脂酸（16：0）占34%，硬脂酸（18：0）占6%，是其主要的NFFA。另外还有月桂酸（12：0）、肉豆蔻酸（14：0）和花生四烯酸（20：4，W⁶^{，9，12，15}）等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较，NFFA在血中浓度很低，其含量水平极易受脂代谢，糖代谢和内分泌机能等因素影响，血中NFFA半寿期为1～2min，极短。血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输，属于一种极简单的脂蛋白。

测定血清NFFA法有滴定法。比色法，原子分光光度法，高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在，极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内，若保存三天，其值约升高30%，使结果不准确。

1．非酶法测定

非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差；高压液相层析法，仪器太昂贵，不便于批量操作。

2．酶测定法

主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A（CoA）进行定量。酶法测定结果准确可靠，快速，易于批量检测。测定原理如图15-6所示。

血清主要FFA酶法测定图

图15-6 血清主要FFA酶法测定图

□：内物质作为生成量与变化量进行测定；ACS：乙酰CoA合成酶；MK：肌激酶；　PK：丙酮酸激酶；POD：丙酮酸氧化酶；DTNB：α-磺基苯甲酸；ACO：乙酰CoA氧化酶；ACD：乙酰CoA脱氢酶。

一、亮度法

1．原理

血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中，形成铜皂在上层溶剂中，再用二苯卡巴肼与铜显色，进行定量。

2．试剂组成

代号	种类	浓度	组成	贮存2～8℃	有效期
R-1	抽提剂		氯仿：庚烷：甲醇=5：5：1（V/V）
R-2	缓冲液	33mmol/L	KH₂PO₄4.539g/L 100ml+Na₂HPO₄·2H₂O5.983g/l 50ml调pH至6.4
R-3	铜贮液	500mmol/L	Cu（NO₃）₂·3H₂o 12.07g加H₂O→100ml
R-4	三乙醇胺	1.0mol/L	三乙醇胺10ml，加水→100ml
R-5	NaOH液	1mol/L
R-6	铜试剂		R-3 10ml+R-4 10ml+R-6 6ml +H₂O→100ml调pH至8.1
R-7	二苯卡巴肼液		二苯卡巴肼（乙醇）液（4g/L）10ml+R-4 0.1ml		临用前配制
R-8	软脂酸标准贮存液	2mmol/L	软脂酸51.2mg溶于100ml R-1液	冷藏
R-9	R-8的应用液	500μmol/L	用R-1液稀释	冷藏

3．操作

按图15-7操作。

4．计算

血清游离脂肪酸（μmol/L）=E_SA/E_ST×500

二、酶法

1．原理

血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸（NEFA），经酶试剂作用生成紫色化合物，其颜色深浅与NEFA含量成正比。

2．试剂组成

代号	种类	组成	浓度贮存	贮存
R1	缓冲液	磷酸缓冲液 MgCl₂液去垢剂	0.04mmol/LpH6.9 3mol/L
R2	酶/辅酶	乙酰CoA合成酶抗坏血酸氧化酶 CoA ATP 4-AAP 溶于10ml R1液中	≥0.3U/ml ≥1.5U/ml 0.9mmol/L 5.0mmol/L 1.5mmol/L	冷藏5日
R3	酶稀释液	苯氧乙醇去垢剂	0.3%(V/V)
R4		马来酰亚胺该试剂与R3等体积混合	10.6mmol/L
R5	酶试剂	乙酰CoA氧化酶过氧化物酶 TOOS 混合上述试剂，再等体积R4试剂混合	≥10U/ml 7.5U/ml 0.2mmol/L	冷藏5日
R6	标准液		1mmol/L	冷藏