附录2　人凝血因子Ⅷ效价测定（二步法）

1　材料

1.1试剂

1.1.10.05mol/L　CaCl2溶液

称7.35gCaCl2·2H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。

1.1.20.025mol/L　CaCl2溶液

称3.675gCaCl2·2H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。

1.1.3　咪唑缓冲液

称0.68g咪唑和1.17gNaCl，溶于约100ml蒸馏水中，加37.2ml0.1mol/l　HCl，加蒸馏水至200ml，pH为7.3～7.4。

1.1.4　枸橼酸盐-氯化钠溶液

1份3.8%枸橼酸三钠溶液加5份0.85%NaCl溶液混匀。

1.1.5Al(OH)3胶

a称（NH4）2SO45.5g，溶于150ml63℃蒸馏水中。

B称氨明矾19.175g，溶于250ml58℃的蒸馏水中。

C最取12.5ml氨水（比重0.88），加12.5ml蒸馏水。

三种溶液配毕后，立即将c液迅速倒入a液中搅匀，然后在搅拌下将此混合液迅速倒入b液，用力搅拌10分钟（保持温度不低于58℃），离心（2500r/min，15分钟），弃上清，沉淀洗涤5次。

第一次：用75ml蒸馏水加0.055ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。

第二次：用75ml蒸馏水加0.11ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。

第三、四、五次分别用75ml蒸馏水洗。

将沉淀物悬浮于总体积为175ml蒸馏水中，混匀，分装，4℃保存。

1.1.6　正常人血清

分别收集20份以上正常人血于干燥灭菌的玻璃瓶中，待血凝固后，放于37℃保温5～6小时，置4℃冰箱过液，分离血清，混匀，定量分装（0.5ml/安瓿），冷冻干燥，-20℃保存。

用时，取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解，然后用咪唑缓冲液作1∶10稀释，4℃冰箱过夜（使血清活化），试验当日再用咪唑缓冲液作最适浓度稀释（一般为1∶20），置冰浴备用。

1.1.7　牛Ⅴ因子

收集公牛血于干燥灭菌的玻璃容器中，室温放置4小时，离心（2500r/min，30分钟），分离血清，取血清加10%（g/ml）BaSO₄在室温下搅拌吸附40分钟，离心（2500r/min，40分钟），弃沉淀，定量（1ml/瓶）分装，冷冻干燥，-20℃保存。

用时取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解，用生理盐水作最适浓度稀释（一般为1∶20），置冰浴备用。

1.1.8　磷脂

取新鲜脑（人，牛，兔），除去表面血管、脑膜，尽可能除去白质，切成薄片，称重，轻轻捣碎，用3倍脑组织的丙酮提取5次，每次用双层绸布滤干，最后脑粉于37℃干燥1小时，称取脑粉1g，加20ml氯仿提取，于室温振摇2小时后，用单层滤纸过滤，滤液放抽气柜内用吹内机吹至微干，加10ml生理盐水研制成白色均匀乳状液，定量（0.1ml/瓶）分装，冷冻干燥，-20℃保存。

用时，取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解后，用盐水作最适浓度稀释（一般为1∶100～1∶500），置冰浴备用。

1.1.9　基质血浆

正常枸橼酸血浆，按3ml分装，-20℃保存。

1.2标准品和样品。

2　操作

2.1试剂混合

取稀释人血清、Ⅴ因子、磷脂等量混合，置冰浴30分钟后备用。

2.2标准品、样品的准备和稀释

2.2.1　若试验血浆对标准血装（标准血浆为未吸附者）：二者按1ml血浆加0.1ml　Al(OH)3悬浮液混合，置37℃水浴吸附3分钟，离心取上清备用。

2.2.2　试验血浆对浓缩标准或试验浓制品对标准血浆：用Ⅷ因子严重缺乏的血浆（Ⅷ因子含量＜1%）稀释浓缩标准品或试验浓制品使成0.5～1.0IU/ml，然后按2.2.1法进行吸附处理。

2.2.3浓缩试验品对浓缩标准品：直接溶解稀释成0.5～1.0IU/ml。

2.2.4标准品和检品准备好后，立即用枸橼酸盐一氯化钠溶液分别作3个连续倍倍稀释，使最低和最高稀释度的凝结时间在17～35秒间（一般为1∶16～1∶256）

2.3　测定

2.3.1　第一步，混合物的保温

取7支玻璃凝集管放入冰浴中，每管加0.3ml混合试剂，然后于第1、2、3管分别加高、中、低稀释度的标准品各0.1ml，第4、5、6管分别加高、中、低稀释度的样品各0.1ml，第7管加枸橼酸盐-氯化钠溶液0.1ml（作空白）；从第1管开始逐管移入37℃水浴，加0.05mol　/L预温CaCl2溶液0.1ml，混匀，记时。每管移入37℃水浴及加CaCl2溶液的时间间隔均为1分钟。

2.3.2　第二步，凝血酶原激活物生成量的测定（取样时间以15分钟和21分钟为例）

另取13支凝集管，每管各加入0.025mol/l　CaCl₂溶液0.2ml，当第一步第1管保温至12分钟时，将此13支凝集管和1支装有基质血浆的试管放入37℃水浴中，待混合物保温至14分钟40秒时，从第1保温管中取出0.1ml混合物加到1支含有0.025mol/l　CaCl₂溶液的凝集管中，于15分钟时，加入0.2ml基质血浆混匀，另用一只秒表记录从基质血浆加入到纤维蛋白形成所需的时间（纤维蛋白形成可用肉眼观察，也可用仪器测量），其余各管每隔1分钟如此依次进行，并于第21～26分钟作第二系列测定，两系列所测得凝结时间不应相差5%（说明稳定的凝血酶原激活物已形成，否则保温时间应调整）。空白管于第27分钟时取样测定。

为了消除试验顺序误差，将标准品和样品的试验顺序改变，2.3.1及2.3.2项过程重复一次。

2.4　计算

2.4.1　作图法

用双对数纸，以凝结时间（秒）为纵坐标，稀释度（如25%、50%、100%……）为横坐标，分别将标准品和样品两套试验结果的平均凝结时间作两条平行线，从100%含量的稀释度处作一垂直线与试验线相交，通过交点作一水平线与标准线相交，再通过交点作一垂直线与横坐标相交，其交点读数即为试验样品相当于标准品的百分含量。若标准线和试验线的直线性、平行关系有显著性差异，或空白试验小于40秒，则分析结果无效。

2.4.2　用3.3平行线法公式计算

样品效价（IU/ml）=log-1（I·V/W）标准品效价·样品稀释倍数×D值

I=0.301(2倍系列稀释法的常数)

V=1/3（T1+T2+T3－S1―S2―S3）

T1、T2、T3为样品3个倍倍稀释度的凝固时间（秒）

S1、S2、S3为标准品3个倍倍稀释度的凝固时间（秒）

若V为负值，变为正值后再代入上面公式计算，若V为正值，变成负值后再代入上面公式计算。

W=1/4（T3－T1＋S3－T1）

D值=标准品的最大稀释度/样品的最大稀释度

3　注意事项

3.1因Ⅷ因子易变不稳定，因此在进行标准品和样品的稀释时，应快而准确，稀释后立即检定，冰浴中不得放置30分钟以上。

3.2试验中各试剂的最适稀释度和混合物保温时间随试剂的变化而异，故应作试验预测，稀释试剂应在冰浴中放置，使用时间超过半天应重新配制。