《实用免疫细胞与核酸》 > 第五章 免疫金银及铁标记技术第三节 胶体金的制备方法
胶体金溶液的制备有许多种方法，其中最常用的是化学还原法，基本的原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等，下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液。
一、制备胶体金的准备
（一）玻璃器皿的清洁
制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾1000g,加入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml）浸泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗3～4次，再用双蒸水把每个器皿洗3～4次，烤箱干燥后备用。通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。也可用已经制备的胶体金溶液，用同等大不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。
（二）试剂的配制要求
（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。
（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右，仍保持稳定。
（3）白磷或黄磷乙醚溶液的配制：白磷在空气中易燃烧，要格外小心操作。把白磷在双蒸水中切成小块，放在滤纸上吸于水份后，迅速放入已准备好的乙醚中去，轻轻摇动，等完全溶解后即得饱和溶液。储藏于棕色密闭瓶内，放在阴凉处保存。
二、制备胶体金的方法和步骤
（一）白磷还原法
1．白磷还原法（zSigmondy 1905年）
（1）取1%的HAuCl4水溶液1ml，加双蒸水99ml配成0.01%的HAuCl4水溶液。
（2）用0.2mol/lK2CO3调pH至7.2。
（3）加热煮沸腾，迅速加入0.5ml20%白磷的饱和乙醚溶液，振荡数分钟至溶液呈现橙红色时即成。胶体金的颗粒直径为3nm左右，大小较均匀。
2．白磷还原法（zSigmondy 1905及z Sigmondy Thiessen 1925）
（1）取0.6%的HAuCl4水溶液2.5ml,加双蒸水120ml 。
（2）用0.2mol/lK2CO3,调pH至中性。
（3）加入1/5饱和度的白磷乙醚溶液1ml（1份白磷4份乙醚），在室温振荡约15min ，溶液呈红褐色，再加热至典型的葡萄酒红色，加热可使乙醚蒸发，胶体金液体内过量的白磷通入空气后被氧化，此方法获得胶体金颗粒的直径在5～12nm之间。
3．白磷还原法的改良法（Henegouwen1986）
（1）取20%饱和度白磷乙醚溶液0.5ml,加双蒸水60ml 。
（2）用1%的HAuCl4水溶液0.75ml,加0.1mol/l K2CO30.6ml, 振荡变成棕红色。
（3）加热煮沸，至溶液变成透明红色。
使用上述方法增加还原次数使金颗粒直径不断增大，二者之间的关系见表5-1。
表5-1 胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系
| 还原次数 | 颗粒直径（nm） | 正负误差 |
| 1 | 5.6 | 0.9 |
| 2 | 6.7 | 0.9 |
| 3 | 7.9 | 0.9 |
| 4 | 9.8 | 1.3 |
| 5 | 12 | 1.0 |
此方法主要优点是简化了制备不同大小的颗粒胶体金的手续和其它试剂的配制,经济、操作简单。另外，在多次还原过程中氯化金不再形成新的金颗粒，只是在原先金粒子基础上使它的直径变大。第一次金颗粒起着“晶核”的作用。由于这一特点，制备的金颗粒相对均匀一致。
（二）抗体血酸还原法（Stathis and Fabrikanos 1958）
（1）将在4℃预冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/l K2CO31.5ml、双蒸水25ml混匀。
（2）在搅拌下加入1ml0.7%抗坏血酸水溶液，立即呈现紫红色。
（3）加双蒸水至100ml，加热至溶液变为透明红色为止。胶体金颗粒直径为8～13nm。
（三）柠檬酸三钠还原法（Frens 1973）
此方法是由Frens在1973年创立的，制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。该法一般先将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色。各种颗粒的胶体金制备详见表5-2。
表5-2 柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系
| 0.01%的HAuCl4（ml） | 1%柠檬酸三钠(ml) | 直径（ml） |
| 100 | 5.0 | 10.0 |
| 100 | 4.0 | 15.0 |
| 100 | 1.5 | 25.0 |
| 100 | 1.0 | 50.0 |
| 100 | 0.75 | 60.0 |
| 100 | 0.60 | 70.0 |
| 100 | 0.42 | 98.0 |
| 100 | 0.32 | 147.0 |
| 100 | 0.25 | 160 |
按照Frens法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来。许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数，基本的规律是柠檬酸三钠用量多，胶体金颗粒直径小，柠檬酸三钠用量越少，腔体金颗粒直径越大。
（四）鞣酸—柠檬酸三钠还原法（Slot与Gueeze1985年）
该法是以1982年Muhlpfordt法为基础，1985年Slot与Geuze对该法进行了改良，特点是通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金，而且颗粒的直径均匀一致，很适合于双标及多标研究。制备3nm、5nm、10nm、15nm的胶体金颗粒见表5-3。
表5-3 鞣酸—柠檬酸三钠还原法
| A 液 | B 液 |
| 直径（nm） | 1%柠檬酸钠（ml） | 0.1mol/L K2CO3ml | 1%鞣酸（ml） | H2O（ml） | 1%HAuCl4（ml） | H2O（ml） |
| 3.3 | 4 | 0.2 | 4 | 11.8 | 1 | 79 |
| 5 | 4 | 0.2 | 0.7 | 15.1 | 1 | 79 |
| 10 | 4 | 0.025 | 0.1 | 15.875 | 1 | 79 |
| 15 | 4 | 0.0025 | 0.01 | 15.987 | 1 | 79 |
操作步骤：
（1）根据所需要的胶体金颗粒分别配制A液和B液。
（2）将配制好的A、B两液在水浴内加热到60℃，并通过控温装置使温度保持稳定。
（3）在电磁搅拌器上搅拌A液迅速加入B液，继续加热直至胶体金变成葡萄酒色，时间大约7～10min。在A、B两液混合后可见溶液立即变成蓝色，大约1～3min就变成红色。
用鞣酸—柠檬酸三钠还原法，柠檬酸三钠主要为还原剂，而鞣酸则有双重作用，一是还原作用，二是保护作用，控制“晶核”的形成过程，也就是说鞣酸的用量多少决定胶体金颗粒的大小形成，因此改变鞣酸的用量就可以改变胶体金的颗粒大小，达到制备不同直径颗粒的胶体金之目的。
（五）乙醇超声波还原法（Baigent and Muller 1980）
（1）1%HAuCl4水溶浓0.2ml加入100ml双蒸水。
（2）用0.2molK2CO3调pH至中性，再加入1ml乙醇。
（3）用20KC、125w超声波探头浸入溶液内进行超声振荡，由此法制得的胶体金颗粒为6～10nm。
（六）硼氢化钠还原法（Tschopp et al 1982）
（1）将预冷在4℃的40ml双蒸水中加入0.6ml 1%的HAuCl4。
（2）再加入0.2molK2CO3，0.2ml。
（3）在搅拌下，迅速加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液（0.5mg/ml）0.4ml,一般重复加入3～5次，直至溶液的兰紫色变为橙红色为至。然后再搅拌5min，获得的金颗粒直径在2～5nm之间。
（七）放射性胶体金的制备方法（Kent and Allen 1981）
（1）取0.01%HAuCl4上水溶液100ml，加热至沸腾。
（2）加入40μl195Au。
（3）迅速加入4ml1%柠檬酸三钠水溶液，5～7min出现透明的橙红色。
（4）其含量为I×106脉冲数/min。
（八）微波制备液体金方法。