荚膜多糖抗原分子大小测定（琼聚糖4B柱层析法）

1　试剂

1.1　琼聚糖4B凝胶。

1.20.2mol　/L　氯化钠溶液，pH7.0洗脱液。

1.3　蓝色葡聚糖2000（2～4mg）加维生素B12（0.2mg），加蒸馏水1ml溶解。

2　仪器

2.1　层析柱（1.5～1.6×100cm）。

2.2　206nm波长紫外监测仪。

2.3　部分收集器及试管。

2.4　凝胶和洗脱液储瓶，适宜的控制装置和记录器。

3　操作

3.1　琼聚糖4B凝胶的漂洗

取琼聚糖4B凝胶约300ml，加0.2mol　/L　氯化钠溶液500ml，充分搅拌，静置1～2小时，倾去上层液体和悬浮于其中的细小颗粒，重复上述操作数次后至上层液体无细小颗粒，置真空罐内，抽去凝胶中的空气。

3.2　装柱

将洗好的琼聚糖4B凝胶慢慢注入柱中，避免夹杂气泡，装至约90cm，调整流速为10～12ml　/小时，流洗2天。

3.3　标定

空流体积（Vo）及柱床总体积（Vi）

取蓝色葡聚糖及维生素B12溶液1ml，加于已平衡的柱上，以0.2mol　/L　氯化钠溶液流洗，用部分收集器收集各组分，流速为10～12ml　/小时，每管2～4ml，同时于206nm波长下自动监测，记录流洗液图谱。第一峰为蓝色葡聚糖峰，计算由加样起至第一峰峰顶的流洗液体积，即为Vo。第二峰为维生素B12峰，计算由加样起至第二峰峰顶的流洗液体积，即为Vi。

3.4　多糖抗原Kd值的测定

3.4.1　取约1ml样品（含多糖抗原3～5mg，冻干样品可用1.2项溶液溶解）。加于已标定的琼聚糖4B胶柱上，用0.2mol　/L　氯化钠溶液流洗，流洗液用量为柱床总体积的1.5倍，每管收集2～4ml，同时于206nm波长下自动监测，记录流洗液图谱，由加样起至多糖峰峰顶流洗体积为Ve，计算分配系数（Kd）。

Kd=Ve―Vo/Vi―Vo

3.4.2Kd≤0.5多糖抗原回收率的计算

用求积仪分别计算Kd值0.5以前组分峰的面积除以所有组分峰的面积，即得Kd≤0.5多糖抗原回收率。

Kd≤0.5多糖回收率（%）=Kd0.5以前组分峰的面积/所有组分峰的总面积×100

注意：过柱操作在10～20℃下进行。