附录2　百日咳菌苗原液免疫力试验方法

1　免疫

1.1　动物

选用体重10～12g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。

将动物随机分为三组，每组16只或20只（同性或雌雄性各半，为保证攻击后有16只或20只小白鼠，可适当多免疫几只小白鼠），同时饲养健康小白鼠55只，备做对照用。

1.2　免疫原稀释

将百日咳原液用生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水稀释至成品菌苗浓度的1/2，然后再稀释7.5×、37.5×、187.5×，百日咳参考菌苗稀释至每ml含8IU，然后再稀释成每ml含1.0IU（0.125ml）、0.2IU（0.025ml）及0.04IU（0.005ml）。

1.3　免疫方法

将不同稀释度的免疫原分别免疫小白鼠，每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。

2　攻击菌及攻击菌液的制备

2.1　菌种

小白鼠脑内攻击用58030（18323）菌株。

2.2　培养基

可用包-姜氏培养基（含羊血20%～30%）或其他适宜的培养基。

2.3　培养温度及时间

放35～37℃培育，第一代不超过72小时，攻击时菌种的培育时间为20～24小时。原代菌种放2～8℃可保存2周。

2.4攻击菌液的制备

将培育20～24小时的菌苔经肉眼检查为纯菌后，刮入生理盐水或pH7.3±0.1缓冲生理盐水，用灭菌脱脂棉过滤，测定浓度，然后用pH7.0～7.2水解酷素、蛋白胨水或肉汤稀释成每0.03ml含菌8万，作为试验组的攻击菌液，然后再连续稀释，使每0.03ml分别含8000、800、80及8个菌，以上5个不同稀释度的菌液，作为对照组的攻击菌液。

2.5　工作起止时间

自攻击菌液制备（开始刮菌）至注射完最后1只小白鼠不得超过2.5小时。

2.6活菌计数

在攻击前后，可将0.03ml含8个菌的攻击菌液，接种于包一姜氏培养基或其他适宜的培养基平皿中，每个平皿0.2ml，每次不得少于2个平皿，其菌落形成单位约为浊度测定的1/4。

3　攻击

动物免疫后14天，每只小白鼠脑内攻击0.03ml菌液（含8万个菌），用0.25ml注射器，4号针头。在试验组攻击后再进行对照组毒力测定，对照组每稀释度攻击10只小白鼠。

4　记录结果

动物攻击后观察14天。攻击后第2天，将试验组动物处理成每组16只或20只。以后逐日观察动物并记录死亡数，最初3天死亡的动物不作统计，至第14天有麻痹、头部肿胀、弓背及明显耸毛的动物按死亡计算。

5　结果计算

5.1　按Wilson-Worcester氏法计算参考菌苗及待检菌苗的ED₅₀±SD%，每个ED50标准差的范围一般应为64%～156%。

5.2　按Reed-Muench氏法计算对照组LD50，1个LD50的菌数应不高于800个菌。

5.3　计算均质性因子“α”。