附录1　百日咳菌苗原液制造及检定要求

本品系用百日咳第Ⅰ相菌种经培育后取菌体制成悬液，加适当杀菌剂，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释制成，每ml含菌45亿～90亿。用于制备百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂。

1　菌种

1.1　制造百日咳菌苗之菌种、检定用的Ⅰ相诊断血清、百日咳分型血清及百日咳参考菌苗，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。

1.2　菌种检定

1.2.1　培养特性

于包-姜（Bordet-Gengou）氏或其他适宜的培养基上培育，各菌株应具有典型的形态及生化特性。

1.2.2　血清学特性

将35～37℃培育40～48小时的菌苔，混悬于生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水内，使每ml含菌20亿个，与Ⅰ相血清做定量凝集反应，凝集效价应达到血清原效价之半。同时与单价分型血清做定量凝集反应，其型别应与该菌种标定型别相同。

1.2.3皮肤坏死试验

用健康家兔或豚鼠至少2只，用培育40～48小时的菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内，然后稀释为几个不同浓度的菌液，分别用每一稀释度的菌液注射于家兔或豚鼠的皮内0.1ml，经72小时观察反应。如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4亿个菌以下的菌液部位出现出血性坏死者为阳性反应，判为合格。

1.2.4　毒力试验

用体重16～18g之小白鼠至少3组，每组至少10只，在麻醉状态下从鼻腔滴入经培育40～48小时，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释的菌液0.05ml观察14天，记录小白鼠生死情况，按Reed　Muench法计算LD50，LD50菌数不超过1.2亿判为合格。

1.2.5　免疫力试验

1.2.5.1　方法

按附录2《百日咳菌苗原液免疫力试验方法》进行。

1.2.5.2判定

试验菌液每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。若试验菌液的效价低于此要求时，可复试，其结果的几何平均值（如用概率分析法时，应用加权几何平均值）≥4.0IU，仍判为合格。

1.3　菌种保存

1.3.1　菌种应用冻干法保存。

1.3.2　冻干菌种应保存在2～8℃。冻干后抽样按1.2项进行检查，合格的菌种可使用2年，以后每年检查1次，如仍合格可继续使用1年。

2.　制造

2.1　制造百日咳菌苗原液至少应选用2个菌株，制成的菌苗应含1、2、3型因子。

2.2　制造百日咳菌苗原液用活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基。如用液体培养基，不得含有已知引起人体毒性或变态反应的成分。

2.3　原液制造

2.3.1　菌种

冻干菌种启开后接种于改良包-姜氏或活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基上。于35～37℃培育不超过72小时，以后各代不超过48小时，传代菌种保存不得超过14天，冻干菌种启开后用于生产时不应超过10代。

2.3.2　培育

可用固体法或液体法培育。培育时间不得超过48小时，经检查为纯菌后，用适当方法收集菌体，混悬于pH值为7.0～7.4的磷酸盐缓冲生理盐水中。

2.3.3　杀菌

原液可用不超过0.1%（ml　/ml）甲醛溶液杀菌，放37℃2～3天。亦可用其他适宜的杀菌剂和杀菌方法杀菌。

2.3.4纯菌试验

原液应逐瓶（罐）抽样接种普通琼脂斜面及普通血液琼脂斜面（或活性炭半综合培养基）各1管，放35～37℃培育2天，然后放24～26℃1天。有杂菌生长者应废弃。

2.3.5　原液合并

固体法工艺生产经纯菌试验合格的原液应进行合并。不同菌株不同日期制造2的原液应分别合并。合并后，可加适量防腐剂，并保存于2～8℃。

2.4　原液检定

2.4.1　浓度测定

每瓶原液应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。稀释菌苗时即按此浓度计算。

2.4.2　镜检

每瓶原液取样稀释至成品浓度，涂片染色镜检，应为革兰氏阴性球杆菌。至少观察10个视野，应无杂菌。

2.4.3　凝集反应

每瓶原液按1.2.2项与Ⅰ相血清做定量凝集试验，其凝集效价应达血清原效价之半，如仅达到或低于血清原效价1/4时，应作免疫力试验，合格后方可使用；同时应用单价分型血清做定性凝集试验，其所含型别应与制造原液的菌种型别相同。

2.4.4　无菌试验

每瓶原液除按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验外，并做特异无菌试验。如特异无菌试验有百日咳菌生长，可复试一次，若仍有百日咳菌生长，原液应判为不合格。

2.4.5　毒性试验

2.4.5.1方法

按附录3《百日咳菌苗原液毒性试验方法》进行。

2.4.5.2　判定

试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前总体重，第7天小白鼠增加的体重不少于对照组增加体重的60%，并不得有死亡，该批原液毒性试验判为合格。

试验结果达不到上述要求，可复试一次。仍达到不过要求，可将原液放置1.2.5项方法及要求进行。

2.5　原液保存

应保存于2～8℃。原液自采集之日起至成品发出不得少于4个月。原液自采集之日起效期为3年。